5. De derde ontwikkelingsweek: gastrulatie
Auteur: Dr. Madeleine Brouns
Zoals beschreven in het vorige hoofdstuk bestaat het humane embryo aan het einde van de tweede ontwikkelingsweek uit twee cellagen, de epiblast en de hypoblast. Beide lagen zijn ontstaan uit de binnenste celmassa van de blastocyst. Het eigenlijke embryo (embryo proper) gaat zich ontwikkelen uit de bovenste cellaag, de epiblast. Uit deze laag ontstaan drie verschillende cellagen, ook wel de kiemlagen genoemd. Het woord ‘kiem’ impliceert al dat uit deze lagen nieuwe structuren zullen gaan ontwikkelen. De drie kiemlagen heten (1) ectoderm, de buitenste laag van het embryo, (2) mesoderm, de middelste laag en (3) endoderm, de binnenste laag. Het proces waarbij deze lagen ontstaan uit de epiblast wordt gastrulatie genoemd. Letterlijk bekent dit maag (gaster) vorming, ter indicatie van het endoderm dat het spijsverteringskanaal zal gaan vormen. Ook worden vóór en tijdens de gastrulatie de drie lichaamsassen bepaald. De volgende onderwerpen komen in dit hoofdstuk aan bod:
- Migratie van epiblastcellen door de primitiefgroeve en de primitiefknop
- Specificatie van de drie kiemlagen
- Bepaling van de drie lichaamsassen
5.1 Migratie van epiblast cellen door de primitiefgroeve en
de primitiefknop
Aan het einde van de tweede ontwikkelingsweek (dag 13) ontstaat er op de caudale middenas van het embryo, (dus aan de staartzijde, in het midden) een langgerekte verdikking van epiblastcellen (zie Appendix voor toelichting anatomische vlakken en termen). Deze verdikking wordt de primitiefstreep genoemd. De primitiefstreep ontstaat ten gevolge van de beweging van epiblastcellen in de richting van de middenlijn. Aan de meest craniale (hoofd)zijde van de primitiefstreep bevindt zich een kuiltje met daaromheen een verdikking, de primitiefknop (figuur 5.1). De primitiefstreep ontwikkelt zich vervolgens in een groeve waardoorheen epiblastcellen naar de binnenkant van het embryo kunnen bewegen om endoderm en mesoderm te vormen. De primitiefgroeve ontstaat in eerste instantie aan de caudale zijde van het embryo, groeit dan uit in de richting van de craniale zijde en trekt zich vervolgens weer terug naar de caudale pool. De maximale lengte is bereikt op dag 16 en de groeve verdwijnt wanneer het proces van gastrulatie is voltooid in het meest caudale deel, aan het einde van de vierde week. Na voltooiing van het proces van gastrulatie worden de epiblastcellen die niet door de primitiefstreep zijn gegaan ectoderm genoemd.
Figuur 5.1 Gastrulatie, de vorming van de drielagige kiemschijf. In (A) is een dorsaal aanzicht van de tweelagige kiemschijf weergegeven met op de caudale middenas de primitiefstreep en uiterst craniaal hiervan de primitiefknop. In de bijbehorende dwarsdoorsnede is de invaginatie van epiblastcellen door de primitiefstreep weergegeven die vervolgens het endoderm (rood) en mesoderm (groen) vormen. In de lengtedoorsnede (B) is de invaginatie van epiblastcellen door de primitiefknop weergegeven waarbij het axiale mesoderm, ofwel de chorda dorsalis (geel), gevormd wordt. De pijltjes illustreren de afgifte van (remmers van) paracriene factoren door de chorda dorsalis aan het bovenliggende ectoderm in verband met de neurale inductie.
De beweging van cellen door de primitiefgroeve wordt ook wel invaginatie of ingressie genoemd. Om in staat te zijn te migreren, verandert eerst de samenhang tussen de epiblastcellen. In eerste instantie vormen deze cellen één laag. Deze organisatie van cellen wordt epitheliaal genoemd. Door de (cadherine) verbindingen tussen de cellen te verbreken, wordt de samenhang losmazig, mesenchymaal genoemd. Epitheliale-mesenchymale transitie (overgang), afgekort tot EMT, is een veel voorkomend biologisch verschijnsel dat optreedt bij de vorming van nieuwe structuren. Het omgekeerde komt ook voor. Mesenchymale-epitheliale transitie (MET) treedt bijvoorbeeld tijdens de ontwikkeling op bij de vorming van nierbuisjes uit losse cellen. De paracriene factor Fibroblast Groeifactor (FGF) 8 speelt een belangrijke rol in EMT tijdens gastrulatie. FGF8 komt vrij uit de primitiefstreep en maakt de beweging van losse epiblastcellen door de primitiefgroeve mogelijk. Deze factor zorgt namelijk voor een verminderde expressie van E-cadherine, een adhesie-eiwit (bindingseiwit) dat ervoor zorgt dat epiblastcellen met elkaar zijn verbonden.
De eerste epiblastcellen die invagineren door de primitiefgroeve vervangen de onderliggende hypoblastcellen en vormen de endodermlaag. De volgende epiblastcellen migreren tussen de (ventrale) endodermlaag enerzijds en de (dorsale) epiblastcellen anderzijds. Deze groep van cellen wordt nu mesoderm genoemd (figuur 5.1 A). Zoals later wordt besproken, differentieert dit mesoderm zich vervolgens in drie verschillende subtypen. Naast epiblastcellen die door de primitiefgroeve migreren, is er een kleine groep van cellen die invagineert bij de primitiefknop. De epiblastcellen die invagineren bij de primitiefknop migreren in craniale richting en vormen een speciaal subtype mesoderm, het axiale mesoderm (figuur 5.1 B). Zoals de naam aangeeft, loopt dit type mesoderm pal over de middenas, van kop tot staart. De wetenschappelijke benaming voor dit subtype mesoderm is chorda dorsalis, notochord in het Engels. Het bezitten van een chorda dorsalis is, althans in aanleg, een kenmerk van alle chordaten. De Chordaten (Latijn: Chordata) behoren tot één stam (phylum) van dieren. Deze stam omvat de gewervelden (Vertebrata), slijmprikken (Myxini), manteldieren (Urochordata) en lancetvisjes (Cephalochordata). Bedenk je dat de naamgeving informatie geeft over de vorm, locatie en het ontstaan van deze structuur: chorda: streng, koord; dorsalis: aan de rugzijde gelegen; noto: (primitief)knop (Engels: primitive node). Eén van de belangrijkste functies van de chorda dorsalis is het induceren van de differentiatie van het bovenliggende ectoderm tot neurectoderm, het toekomstige zenuwweefsel (zie hoofdstuk 6).
De aanmaak van de chorda dorsalis heeft invloed op de lengte van de primitiefgroeve. De eerste chorda dorsalis cellen worden uiterst craniaal afgezet. De chorda dorsalis groeit van craniaal naar caudaal doordat de volgende chorda dorsalis cellen achter de eerste cellen aansluiten. Dit proces zet zich voort totdat er ruimtegebrek is tussen de primitiefknop en de laatst afgezette chorda dorsalis cellen. De chorda dorsalis veroorzaakt hierdoor een stuwkracht naar de primitief knop in caudale richting wat weer ruimte genereert voor andere epiblastcellen om te kunnen invagineren en aan te sluiten op de chorda dorsalis. Dit proces zet zich voort totdat enerzijds de chorda dorsalis de gehele lichaamsas bestrijkt en anderzijds de primitiefknop tot uiterst caudaal is teruggedrongen en uiteenvalt. In het craniale deel van het embryo waar de primitiefgroeve niet (meer) aanwezig is en de chorda dorsalis is aangelegd, is het gastrulatieproces voltooid en gaan de achtergebleven epiblastcellen zich differentiëren tot verschillende typen ectoderm. Caudaal echter, is het proces van gastrulatie dan nog in volle gang. Voor veel structuren geldt deze craniale naar caudale gradiënt van ontwikkeling. De craniale zijde ontwikkelt zich eerder dan de caudale zijde. Denk bijvoorbeeld ook aan de ontwikkeling van de ledematen, de armen onstaan eerder dan de benen en de armen zullen ook weer eerder handen en vingers vormen dan dat de benen voeten en tenen vormen.
5.2 Specificatie van de drie kiemlagen
Na de gastrulatie is het embryo drielagig geworden. Uit de drie kiemlagen ontstaan vervolgens verschillende embryonale structuren. Daarnaast wordt een aparte groep van cellen gespecificeerd in de epiblast, namelijk de primordiale (oergeslachts) cellen. Deze toekomstige zaad- en eicellen, behoren dus niet tot één van de drie kiemlagen (tabel 5.1).
Tabel 5.1 Afgeleide structuren van de drie kiemlagen: endoderm, mesoderm en ectoderm. De primordiale geslachtscellen vormen een aparte groep van cellen en behoren niet tot één van de drie kiemlagen.
| Endoderm |
Mesoderm |
Ectoderm |
Primordiale geslachtscellen |
| Darm |
Spieren |
Zenuwstelsel |
Oöcyten |
| Lever |
Botten |
Neurale lijst cellen |
Spermatozoa |
| Alvleesklier |
Nieren |
Huid |
|
| Longen |
Geslachtsorganen |
Haar |
|
| Schildklier |
Bloedvaten |
Zweetklieren |
|
| Galblaas |
Bloed |
|
|
Zoals eerder genoemd, ontstaat uit het endoderm het spijsverteringskanaal met de daarvan afgeleide organen zoals de longen, lever en alvleesklier. Uit het ectoderm ontstaat enerzijds zenuwweefsel en anderzijds de epidermis (opperhuid) en afgeleiden daarvan, zoals haren en zweetklieren. De rest van het embryo wordt gevormd uit het mesoderm. Hierin zijn, naast de chorda dorsalis, drie subtypen te onderscheiden met ieder een eigen groep van afgeleide structuren. Vanaf de middenas (axiaal) naar de zijkant (lateraal) geredeneerd, zijn dit het paraxiale mesoderm (para: naast de middenas), intermediaire mesoderm (‘in het midden’) en laterale mesoderm (‘aan de zijkant’). Deze terminologie verwijst naar de platte drielagige kiemschijf (figuur 5.2). Wanneer het embryo kromt in de vierde week, door o.a. de expansie van de amnionholte, zullen het laterale en intermediaire mesoderm aan de ventrale zijde komen te liggen en het axiale en paraxiale mesoderm aan de dorsale zijde (zie hoofdstuk 6).
Figuur 5.2 Ontwikkeling en positie van de verschillende onderdelen van het mesoderm. (A) Dorsaal aanzicht van de drielagige kiemschijf met het buccofaryngeale en cloacale membraan aan, respectievelijk, de craniale en caudale zijde. De pijlen geven de migratie weer van de vier verschillende onderdelen van het mesoderm. Vanaf de middenlijn beschouwd zijn dit: het axiale, het paraxiale, het intermediaire en het laterale mesoderm. In het dorsale aanzicht waarbij de ectodermlaag verwijderd is (B) en in de dwarsdoorsneden (C en D) zijn deze onderdelen naast elkaar te zien.
Op twee plaatsen in het embryo liggen het ectoderm en endoderm tegen elkaar aan: het buccofaryngeale membraan en het cloacale membraan, zie figuur 5.2. Het axiale mesoderm, de chorda dorsalis, speelt een belangrijke rol bij de eerste ontwikkeling van het zenuwweefsel en van het paraxiale mesoderm. In het latere leven blijft deze structuur bestaan in de tussenwervelschijven maar speelt verder geen rol van betekenis. Het paraxiale mesoderm ontwikkelt zich tot de oersegmenten, de somieten. Bij de mens worden 44 paar somieten gevormd, opeenvolgend op de lichaamsas. De individuele somieten vallen vervolgens uiteen in drie onderdelen: het dermatoom, het myotoom en het sclerotoom. Uit het dermatoom ontstaat onderhuids bindweefsel, uit het myotoom rug- en skeletspieren en uit het sclerotoom de wervels, al dan niet met een rib. Hierover lees je meer in hoofdstuk 6. Het menselijk lichaam is dus opgebouwd uit segmenten, ook al zie je daar aan de buitenzijde niks meer van. Het volgende subtype mesoderm, het intermediaire mesoderm, differentieert tot het urogenitaal stelsel. Dit systeem omvat enerzijds de nieren en afvoerbuizen hiervan (‘uro’) en anderzijds de geslachtsorganen (teelballen en eierstokken; ‘genitaal’). Tot slot, het laterale plaat mesoderm. Hieruit ontstaat enerzijds het vasculaire systeem, het hart en de bloedvaten. Anderzijds splitst het laterale mesoderm in twee bladen, het zogenaamde viscerale (orgaanstandige) blad en het pariëtale (wandstandige) blad. Het viscerale blad zorgt voor de bekleding van de organen en het pariëtale blad zorgt voor de bekleding van de lichaamsholte.
5.3 Bepaling van de drie lichaamsassen
Om van een bevruchte eicel een embryo te vormen is er zowel een toename van cellen nodig door proliferatie (celdeling) als ook een toename van celtypen door differentiatie. Daarnaast dient er polariteit ofwel verschillende uiteinden, gegenereerd te worden om de toekomstige lichaamsassen te bepalen. Waar is het hoofd, waar de staart? Waar is de rug en waar is de buik? Waar is de linkerzijde en waar de rechter? Voorafgaand aan en tijdens de gastrulatie worden de drie lichaamsassen, respectievelijk de anteriore-posteriore (A-P), de dorsale-ventrale (D-V) en de links-rechts (L-R) as bepaald.
Figuur 5.3 Bepaling van de lichaamassen. Dorsaal aanzicht van gastrulerende embryo’s. Craniaal aan de linker zijde in (A) en aan de bovenzijde in (B) en (C); caudaal aan de rechterzijde in (A) en aan de onderzijde in (B) en (C). (A) Bij de bepaling van de anteriore-posteriore as speelt de concentratie van Nodal een belangrijke rol. Deze paracriene factor wordt geproduceerd in de primitiefknop. Tegelijkertijd worden er Nodal remmers (Lefty1, DKK1 en Cerberus) afgegeven door het anteriore viscerale endoderm (AVE) dat is gespecificeerd door GATA6. Een lage concentratie van Nodal activiteit bepaalt de locatie van het hoofd, een hoge concentratie de locatie van de romp. (B) Dorsale-ventrale specificatie van het mesoderm wordt gereguleerd door de aan- of afwezigheid van BMP4 activiteit. Dichtbij de primitief knop wordt BMP4 geremd (door Noggin, Follistatin en Chordin) en krijgt het mesoderm een dorsaal karakter, verder weg van de primitief knop is de concentratie van de remmers te laag en zal BMP4 het mesoderm differentiëren tot intermediair en lateraal mesoderm. (C) De links-rechts as is bepaald met het ontstaan van de twee andere assen. De verdere L-R ontwikkeling verloopt voor een aantal organen echter niet symmetrisch. Deze links-rechts asymmetrie wordt bewerkstelligd door de ophoping van specifieke paracriene factoren en transcriptiefactoren aan de linkerkant, zoals Nodal, Lefty2 en PITX2. Rechts is de transcriptiefactor Snail unilateraal actief. Linksdraaiende trilharen op de primitiefknop (aangegeven met pijlen) zorgen voor afgifte van FGF8 aan de linkerkant van het embryo, wat vervolgens de expressie van Nodal, Lefty2 en PITX2 aan de linkerkant verhoogt. Een alternatieve theorie stelt dat de links-gerichte stroom wordt gedetecteerd door een calcium kanaal en dat calcium verhoging aan de linkerkant vervolgens leidt tot asymmetrische expressie van Nodal pathway genen.
In muizenembryo’s is gevonden dat de bepaling van de A-P as zijn oorsprong heeft in het blastocyst stadium, waar een gebied wordt gespecificeerd door differentiële genexpressie van o.a. de transcriptiefactor GATA6. Dit gebied, anterior visceraal endoderm (AVE) genoemd, geeft vervolgens factoren af die essentieel zijn voor de vorming van het hoofd (figuur 5.3 A). Epiblastcellen die ver verwijderd zijn van het AVE gebied krijgen deze signalen niet en nemen de identiteit aan van de toekomstige staart/stuitje. De AVE signaalfactoren zijn o.a. Lefty1 (Left-Right Determination Factor 1), dit is een Nodal antagonist (remmer), DKK1 (Dickkopf-gerelateerd eiwit 1), een WNT antagonist en Cerberus, een multifunctionele antagonist van de paracriene factoren WNT, Nodal en BMP (Bone morphogenetic protein). Nodal en BMP zijn beide eiwitten uit de TGF-β familie van paracriene factoren. De naam Nodal refereert naar de primitive node, de primitiefknop. Deze wordt ook wel Hensen’s node of organizer genoemd, gezien zijn belangrijke functie in het organiseren van de verschillende structuren in het embryo. Hier komt Nodal tot expressie en deze factor initieert en onderhoudt vervolgens de vorming van de primitiefstreep. Samengevat: anterior wordt de functie van Nodal geremd (lage concentratie Nodal en hoge concentratie remmers, zie figuur 5.3 A) en wordt het hoofd gevormd; meer posterior, bij de primitief knop, is de activiteit van Nodal hoog (hoge concentratie Nodal en lage concentratie remmers) en wordt het caudale deel gevormd.
Over de bepaling van de D-V as bij zoogdieren is erg weinig bekend. Deze as wordt als eerste van de drie assen gespecificeerd. Al in het blastocyst stadium is er sprake van D-V polariteit aangezien de ventrale hypoblastcellen altijd aan de zijde van de blastocoel liggen en de dorsale epiblastcellen in contact staan met de amnionholte en de trofoblast. De primitiefstreep houdt deze polariteit vervolgens in stand, zodat epiblastcellen altijd in ventrale richting migreren tijdens de gastrulatie. Bij de verdere differentiatie van het mesoderm in dorsale en ventrale subtypen speelt de activiteit van de paracriene factor BMP4 een grote rol. Dit is gebleken uit onderzoek in met name Xenopus laevis (Afrikaanse of reuzenklauwkikker). BMP4 is aanwezig in het hele embryo, maar wordt onderdrukt in de gebieden die een dorsaal karakter krijgen. In aanwezigheid van zowel actief BMP4 als FGF wordt mesoderm geventraliseerd om later te ontwikkelen tot intermediair en laterale plaat mesoderm. Dorsaal, (par)axiaal, mesoderm ontstaat wanneer BMP4 lokaal wordt geremd. Dit gebeurt door een aantal factoren die afgegeven worden door de primitiefknop (en later door de chorda dorsalis). Deze BMP4 remmers zijn: Noggin, Follistatin en Chordin. Vanuit de knop ontstaat er een gradiënt van BMP4 remmers, waardoor het mesoderm dicht bij de knop gedorsaliseerd wordt en mesoderm dat verder weg ligt, en dus minder BMP4 remmers ontvangt, geventraliseerd wordt (figuur 5.3 B). Noggin, Follistatin en Chordin binden aan BMP4 en verhinderen daarmee dat BMP4 aan diens receptor kan binden. De signaaloverdracht tussen de inducer en de competente responder is op deze manier geblokkeerd. Dezelfde BMP4 remmers komen later tot expressie in de chorda dorsalis en spelen dan een belangrijke rol bij de neurale inductie (zie hoofdstuk 6).
Met het ontstaan van de D-V en de A-P as is ook de laatste as, de L-R as, van het embryo per definitie vastgesteld. De primitiefstreep op de middenlijn geeft beide zijden duidelijk weer. Echter, de ontwikkeling van een aantal organen verloopt vervolgens niet symmetrisch. Voorbeelden hiervan zijn het hart, de longen, de darmen, de lever, de alvleesklier en de milt. Deze organen zijn ofwel aan één kant gepositioneerd, ofwel anders van vorm aan de linkerkant vergeleken met de rechterkant. Deze L-R asymmetrie ontstaat vroeg tijdens de ontwikkeling en wordt aangestuurd door een cascade van signaleringsmoleculen en genen. De specificatie van de linkerkant gebeurt onder invloed van FGF8, afgegeven door de primitiefknop en -streep, en Nodal, Lefty2 en de transcriptiefactor PITX2, aan de linkerkant van het embryo. Daarnaast verhinderen Lefty1 en SHH de expressie van ‘linkerkant’ genen aan de rechterkant. Rechterkant specifieke genen zijn minder goed bekend, met uitzondering van de transcriptiefactor Snail waarvan de expressie beperkt is tot de rechterzijde. Waarschijnlijk stuurt de transcriptiefactor Snail andere genen aan, die verantwoordelijk zijn voor de bepaling van de rechterzijde (figuur 5.3 C). Wanneer de L-R asymmetrie niet juist ontwikkelt, is er sprake van situs inversus. De organen liggen gespiegeld in het lichaam. Dit hoeft niet problematisch te zijn, maar kan gepaard gaan met andere afwijkingen aan bijvoorbeeld de luchtwegen of de kwaliteit van de zaadcellen. Deze bevindingen hebben tot de ontdekking geleid dat één van de primaire stappen in het ontstaan van L-R asymmetrie te maken heeft met cilia (trilhaartjes) die aanwezig zijn op de primitiefknop. Deze cilia zijn qua structuur vergelijkbaar met de trilharen in de luchtwegen en de flagel (zweepstaart) van de zaadcellen. De cilia op de primitiefknop zorgen voor een linkswaartse stroming, de nodal flow. Het effect van de nodal flow op de totstandkoming van de linksrechts asymmetrie wordt verklaard door twee theorieën. Volgens de morfogeen hypothese zorgen de cilia op de primitiefknop voor een linkswaartse stroming waardoor factoren zoals FGF8 in hogere mate aanwezig zijn aan de linkerkant. Een andere theorie, de 2 cilia hypothese, stelt dat de beweeglijke cilia op de primitiefknop de nodal flow veroorzaken die vervolgens wordt gedetecteerd door de onbeweeglijke cilia in de periferie van de primitiefknop. Dit gebeurt via PKD2 (polycystic kidney disease 2), een calciumkanaal wat leidt tot een verhoogd calcium niveau aan de linkerkant. Calcium zou vervolgens asymmetrische expressie van Nodal pathway genen bewerkstelligen. Wanneer deze cilia niet goed functioneren, leidt dit tot luchtweginfecties en (mannelijke) onvruchtbaarheid, al dan niet in combinatie met situs inversus.
Literatuur
- Schier AF & Shen MM. Nodal signalling in vertebrate development. Nature 403, 385-389 (2000).
- Takaoka K & Hamada H. Cell fate decisions and axis determination in the early mouse embryo. Development 139, 3-14 (2012).
- Ferguson EL. Conservation of dorsal-ventral patterning in arthropods and chordates. Curr Opin Genet Dev 6, 424-431 (1996).
- Hirokawa N, Tanaka Y & Okada Y. Left-right determination: involvement of molecular motor KIF3, cilia, and nodal flow. Cold Spring Harb Perspect Biol 1, a000802 (2009).
- Robb L & Tam PP. Gastrula organiser and embryonic patterning in the mouse. Semin Cell Dev Biol 15, 543-554 (2004).
- Sadler TW. Langman’s Medical Embryology. Elfde druk. Philadelphia PA, Lippincott Williams & Wilkins (2010).
- Babu D & Roy S. Left-right asymmetry: cilia stir up new surprises in the node. Open Biol. 2013 May 29;3(5):130052.
