Life Science Instrumentele Analyse

Life Science Instrumentele Analyse

Instrumentele Analyse tbv Life Science

Deze WikiWijs is bedoeld ter ondersteuning bij het analytische onderdeel van het vak Life Science. Elke techniek heeft zijn eigen onderdeel met uitleg en overige ondersteuning.

 

Chromatografie

Chromatografie is een veel gebruikte techniek voor analyse en scheiding. De techniek berust op verschil in absorptievermogen (en in enkele gevallen ook oplosbaarheid). We zullen eerst de algemene eigenschappen van chromatografie bekijken, daarna zullen we diverse chromatografie-technieken bekijken. De nadruk zal liggen op gaschromatografie, maar ook de papier- en kolomchromatografie zullen kort de revue passeren.

Chromatografie - Algemeen

In alle gevallen berust chromatografie op scheiding door middel van adsorptievermogen van een bepaalde stof aan een stationaire fase. Een veel gebruikte analogie is die van een winkelstraat vol kledingwinkels: een grote groep mensen staat aan het begin van een winkelstraat, zij moeten de straat doorlopen. De kledingliefhebbers doe er veel langer over dan de niet-kledingliefhebbers omdat de eerste steeds de kledingwinkels binnen gaan.

Voor homogene mengsels werkt het net zo: een mengsel van polaire en apolaire moleculen aan het begin van een polaire buis. De polaire moleculen hebben een veel groter aanhechtingsvermogen met de polaire buis en zullen dus veel langzamer door de buis bewegen. Er moet echter wel een drijvende kracht zijn die de moleculen door de buis laat bewegen. Deze kracht is een continu bewegende fase die door de buis stroomt (gas of vloeistof). 

Stationaire fase en mobiele fase

De stationaire fase is de niet bewegende fase bij chromatografie deze beweegt niet en is bijna altijd een vaste stof (soms een vloeistoflaagje aan de binnenkant van een buis bij gaschromatografie). 

De mobiele fase is de fase die ervoor zorgt dat het mengsel door de buis (kolom) "loopt", dit is altijd een gas (gaschromatografie) of vloeistof (vloeistofchromatografie). 

Er is altijd een verschil in polariteit tussen de stationaire en mobiele fase. 

Papierchromatografie

Al in de derde klas komen leerlingen bij scheikunde in aanraking met papierchromatografie. De mobiele fase is dan vaak water, de stationaire fase is een stuk filtreerpapier. Door stiftpunten op het papier aan te brengen en deze in het water te zetten kan er een scheiding optreden tussen de diverse kleuren waaruit de inkt is opgebouwd. 

Kleurstoffen met een grote affiniteit met het papier (groot adsorptievermogen) zullen laag op het papier achterblijven terwijl kleurstoffen die goed oplosbaar zijn in het water juist bovenaan het papier (dicht bij het vloeistoffront) uitkomen. 

In deze zin is papierchromatografie vooral bedoeld als analysemethode, je kunt zien uit welke kleuren de inkt is opgebouwd. 

Aan de linkerkant zie je een papierchromatografie van een zwarte stift, de onderste potloodstreep is waar de inkt is opgebracht. De bovenste potloodstreep is het vloeistoffront. 

Retentiefactor

Door steeds onder dezelfde omstandigheden (zelfde mobiele en stationaire fase en zelfde temperatuur) chromatografie toe te passen zullen specifieke stoffen steeds dezelfde afstand ten opzichte van het vloeistoffront afleggen. Deze afstand heet de retentiefactor.

In de afbeelding rechts zie je een voorbeeld. Stof A, de rode kleurstof heeft een afstand afgelegd die overeenkomt met de rode pijl. De zwarte pijl is de afstand die het vloeistoffront heeft afgelegd vanaf de lijn waarop de monsters zijn aangebracht. De retentiefactor is dan:

\(R_f=\frac{\text{afgelegde weg monster}}{\text{afgelegde weg vloeistoffront}}\)

 

Papierchromatografie

Dunnelaagchromatografie

Dunnelaagchromatografie is erg vergelijkbaar met papierchromatografie. In essentie is het vrijwel dezelfde techniek maar dan "proffesioneel". 

Het grootste probleem met de standaard papierchromatografie is dat deze alleen goed werkt voor gekleurde stoffen. De meeste stoffen zijn echter niet gekleurd. Daarvoor biedt dunnelaagchromatografie (in het Engels: Thin Layer Chromatography, TLC) uitkomst. 

Bij TLC wordt gebruik gemaakt van een dunne laag stationaire fase op een stevige drager. Vaak is de dunne laag silicagel op een aluminium drager. De mobiele fase is een vloeistof (niet altijd water).

U.S.National Library of Medicine

De monsters worden net als papierchromatografie genomen. Echter daarna zijn de vlekken nog niet zichtbaar op het chromatogram. Hiervoor moet het plaatje nog een behandeling ondergaan. Meestal wordt het plaatje beschenen met UV-licht, verbindingen die hiervoor gevoelig zijn zullen dan oplichten. Daarnaast zijn er nog veel meer andere mogelijkheden om de vlekken zichtbaar te maken. Zo kunnen onverzadigde verbindingen zichtbaar gemaakt worden met jooddamp (zie hiernaast).

 

Dunnelaagchromatografie

Kolomchromatografie

Kolomchromatografie is een techniek die net even anders is dan papier- en dunnelaagchromatografie. Deze laatste twee vertrouwen op de capillaire werking van de vloeistof in de stationaire fase. Kolomchromatografie vertrouwt voornamelijk op de zwaartekracht (of een extern drukverschil).

Kolomchromatografie is ook anders in de zin dat het gebruikt kan worden als daadwerkelijke scheidingsmethode.

Omdat kolomchromatografie vaak gebruik wordt om reactiemengsels te zuiveren (en de bijproducten van een reactie vaak op het gewenste eindproduct lijken), luistert de keuze van het oplosmiddel vrij nauw. Soms werken scheidingen dan niet zoals ze zouden moeten werken, maar ook de pakking van de (vaak met silicagel gevulde) kolom is een secuur werkje. 

Animatie kolomchromatografie

HAN - storten van een kolom

Hieronder een practicum voor vwo 6, leerlingen maken kennis met het uitvoeren van een kolomchromatografie op microschaal. 

Gaschromatografie - GC

Verreweg de meest gebruikte chromatografietechniek als het gaat om nauwkeurige kwalitatieve en kwantitatieve analyse van mengsel. De eerder genoemde technieken zijn kwantitatief niet toepasbaar en zijn in die zin dus niet geschikt.

Gaschromatografie gebruikt als mobiele fase een (inert) draaggas wat het mengsel door de kolom stuwt. De kolom is niets meer dan een holle buis die aan de binnenkant gecoat is met de stationaire fase en in een oven gemonteerd is. De stationaire fase kan een dun laagje vaste stof zijn, maar ook een coating van een polymeer materiaal of een vloeistoffilm.

Het daadwerkelijk uitvoeren van de analyse is niet ingewikkeld, het apparaat doet het werk voor je. De interpretatie van het resultaat (chromatogram) en eventueel aanpassen van de parameters voor een nieuwe meting is ingewikkelder.

De detector van een gaschromatograaf (GC) registreert het passeren van een stof, er zijn verschillende soorten detectoren die op verschillende manieren op een stof reageren. Allen geven ze een signaal dat sterker is naarmate er meer stof passeert. Het probleem is echter dan kleine hoeveelheden stof A een even grote piek op kunnen leveren als een grote hoeveelheid stof B. 

 

 

 

Pieken

In een chromatogram wil je een goede scheiding met pieken die zoveel als mogelijk losstaan van elkaar. Bij voorkeur smalle symmetrische pieken, deze geven het beste resultaat bij verdere verwerking voor kwantitatieve analyse.

Een aantal aspecten zorgen voor verandering in de pieken:

  • Eddy-diffusie, dit is het fenomeen dat een kolom niet homogeen gepakt is, en dus verschillende deeltjes een verschillende weg door de kolom afleggen. Hierdoor verdeelt de stof zich over een steeds groter deel van de kolom. Uiteindelijk levert dit bredere pieken op. (zie ook hier)
  • Stroomsnelheid van de mobiele fase

Karakteristieken van pieken:

Retentietijd (\(t_r\)): de tijd vanaf het moment van injectie van het monster tot het moment waarop de desbetreffende stof de detector passeert.

Hold-up tijd of dode tijd (\(t_m\)): de tijd die de mobiele fase nodig heeft om door de kolom heen te gaan. Dit is de tijd waarop een stof met geen enkele affiniteit voor de kolom langs de detector komt. Vaak is dit het oplosmiddel wat een piek in het chromatogram geeft. De hold-up tijd kan berekent worden als het zogenaamde "dode volume" van de kolom en de stroomsnelheid van de mobiele fase bekend zijn.

Retentiefactor of capaciteitsfactor (\(k\)): deze factor wordt voor iedere piek apart berekend met behulp van de volgende formule: \(k=\frac{t_r}{t_m}-1\). De retentiefactor beschrijft de verhouding tussen de netto retentietijd (de tijd die de stof langer in de kolom verblijft zonder de hold-up tijd) en de hold-up tijd. Hoe groter deze factor, hoe meer tijd een monster spendeert in de stationaire fase van de kolom in tegenstelling tot de mobiele fase. Bij voorkeur wil je een retentiefactor tussen 1 en 10.
Het voordeel van een retentiefactor boven de retentietijd, is dat de retentiefactor niet afhankelijk is van de stroomsnelheid van de mobiele fase en de lengte van de kolom.

Selectiviteitsfactor (\(\alpha\)): voor een mengsel van twee componenten kan een selectiviteitsfactor berekend zijn door: \(\alpha=\frac{k_2}{k_1}\) met daarin \(k_2 > k_1\). Hoe groter de selectiviteitsfactor is, hoe beter beide componenten van elkaar te scheiden zijn.

Resolutie (\(R_s\)): De resolutie van een chromatogram (voor twee pieken) zegt iets over de mate van overlap. Hoe minder overlap, hoe beter oppervlaktes te bepalen zijn en hoe betrouwbaarder kwantitatieve uitspraken zijn. De resolutie kan bepaald worden door gebruik te maken van de piekbreedte op halve hoogte (\(w_{1/2}\), deze is veel beter meetbaar dan de piekbreedte op de basislijn. 

De resolutie tussen pieken A en B is dan te berekenen als volgt:

\(R_s=\frac{t_r(B)-t_r(A)}{0,85(w_{1/2}(A)+w_{1/2}(B))}\)

Over het algemeen is de resolutie prima als \(R_s>1,5\). Er is dan minder dan 1% interferentie tussen beide pieken. 

Uiteraard hebben de retentie- en selectiviteitsfactor ook te maken met resolutie. Het is dan ook mogelijk om de resolutie te berekenen uit beide factoren, als we daarin ook het zogenaamde schotelgetal meenemen. 

 

Schoteltheorie

De schoteltheorie wordt gebruikt om de effectiviteit van een kolom theoretisch te optimaliseren en benaderen. In de praktijk is dit een weinig gebruikte methode, maar hij geeft wel een aantal interessante inzichten. 

De theorie beschouwd een kolom als een grote kolom met schotels, waarbij op iedere schotel er een evenwicht van het analyt is tussen de stationaire en mobiele fase. Het analyt ondergaat:

  • Eddy diffusie, wat voornamelijk te maken heeft met de packing van de kolom hierbij hoort de coëfficiënt \(A\).
  • Longitudinale diffusie, het analyt zal door Brownse beweging en capilaire werking over de hele lengte van de kolom willen verspreiden. Hierbij hoort de coëfficiënt \(B\).
  • Massatransport tussen mobiele en stationaire fase. Dit zegt iets over de snelheid waarmee het analyt kan overgaan tussen mobiele en stationaire fase. Hierbij horen de coëfficiënten \(C_s \) en \(C_m\).

Net als bij destillatie geldt dat hoe meer schotels, hoe effectiever de scheiding tussen componenten zal zijn. Het totale aantal schotels (\(N\)) moet dus zo groot mogelijk zijn. Aangezien de lengte van een bepaalde kolom (\(L\)) niet variabel is (tenzij er een andere kolom gebruikt wordt) is te berekenen hoe hoog in theorie de schotels zijn (\(H= \frac{L} {N}\)), in dit geval zijn lage schotels het meest effectief (meer schotels in een kolom. De theoretische schotelhoogte is te berekenen uitgaande van de hierboven genoemde coëfficiënten voor diffusie en transport en de stroomsnelheid van de mobiele fase. Dit is de Van Deemter vergelijking:

\(H=A+{B\over \bar{u}}+(C_s+C_m)\bar{u}\)

Hierin is \(\bar{u}\) de gemiddelde stroomsnelheid van de mobiele fase. Als de theoretische schotelhoogte uitgezet wordt tegen de stroomsnelheid levert dat de volgende grafiek:

Bij lage stroomsnelheden is er veel tijd voor het analyt om diffusie in de lengte van de kolom te ondergaan, dat is uiteraard ongewenst, dit leidt tot piekverbreding. Wel levert een lage stroomsnelheid vaak betere scheiding omdat de retentietijden hoger zijn (hogere capaciteitsfactor en bijbehorende selectiviteit)

Een hoge stroomsnelheid is ook niet optimaal, immers de stoffen hebben dan een erg lage retentietijd, de selectiviteitsfactor zal dan ook laag zijn. Pieken gaan overlappen of zijn helemaal niet meer te onderscheiden. Bij te hoge stroomsnelheden is er steeds minder kans voor het analyt om in evenwicht te zijn tussen de mobiele en stationaire fase. Er treedt uiteindelijk ook piekverbreding op omdat het analyt zich over de hele kolom verspreid.

De Van Deemter vergelijking geeft aan dat er dus een optimale stroomsnelheid van de mobiele fase is. In de praktijk wordt deze vergelijking nauwelijks gebruikt maar vertrouwt men op de expertise van de analist. 

 

Algemeen

Om pieken zo smal mogelijk te krijgen met een hoge selectiviteit zijn er een aantal (logische) punten:

  •  De meeste Van Deemtervergelijkingen lopen vrij vlak (de bijdrage van \(C\) is relatief klein). Met een hoge stroomsnelheid kan dan toch een relatief lage theoretische schotelhoogte bereikt worden. Bijkomend voordeel is dan dat er niet zo lang gewacht hoeft te worden op de resultaten van de analyse.
  • Een pakking met deeltjes met kleine diameter verkleint de bijdrage van \(A\), immers de te volgen wegen voor verschillende deeltjes zijn dan vergelijkbaar.
  • Een kolom met een kleine diameter en een dunne stationaire fase zorgt ervoor dat stoftransport sneller kan plaatsvinden en verkleint zo de bijdrage van \(C\).
  • De invloed van de temperatuur kan groot zijn, deze is voor nu buiten beschouwing gelaten. Maar bij hogere temperatuur in een GC is er meer diffusie, juist een lagere temperatuur kan dus gunstig zijn (maar ook dit brengt weer nadelen met zich mee als het gaat om selectiviteit).

Kwantitatieve bepalingen

Het piekoppervlak in een chromatogram is recht evenredig met de hoeveelheid stof die de detector passeert. Het probleem is dat niet iedere stof gelijk reageert op de detector. Zo kan een lage concentratie van een stof toch een hoge piek opleveren. Om dit op te lossen kunnen verschillende methodes gebruikt worden. We bespreken er twee: 

  • De interne standaard: er wordt een extra stof toegevoegd aan het monster met bekende concentratie. Door de verhoudingen tussen de pieken kan dan berekend worden wat de oorspronkelijke concentratie is.
  • Standaardadditie: deze methode wordt vooral gebruikt bij ijkreeksen. Eigenlijk is dit een normale ijkreeks, maar het analyt wordt opgelost in het monster. Hiermee kunnen matrixeffecten verminderd worden.

Interne standaard

Een monster bevat een onbekende stof A die gemeten moet worden. Het chromatogram van het monster ziet er uit zoals hier rechts. Stof A heeft een retentietijd van 11 minuten. Bij het meten van het monster is 1·10–3 M van een stof S (de interne standaard) toegevoegd. De standaard heeft een retentietijd van 20 minuten. De verhouding tussen de piekoppervlakten van stof A en stof S is 1,25 : 1,00.

Dit wil dus expliciet niet zeggen dat er 1,25 keer zoveel stof A in het monster zit. We moeten eerst bepalen hoe verschillend de detector reageert op stof A in vergelijking met de standaard. Dit wordt ook wel de relatieve responsfactor genoemd. Deze is voor twee gegeven stoffen op een bepaald apparaat met vaste omstandigheden gelijk. Om deze te bepalen wordt een ander chromatogram opgenomen met daarin bekende hoeveelheden van stof A en stof S:

De concentraties van beide stoffen zijn gelijk aan elkaar: namelijk 1,0·10–2 M. De verhouding tussen de pieken is in dit geval 1,00 : 1,50.

Je kunt met deze gegevens nu uitrekenen hoe groot de concentratie stof A in het mengsel is.

Eerste aanpak:
De detector van de chromatograaf meet de piek van de standaard eigenlijk een factor 1,50 te groot ten opzichte van stof A (bij gelijke concentraties). In het daadwerkelijke chromatogram moet de piek van de standaard dus met een factor 1,50 verkleind worden.

Als we dat doen wordt de nieuwe verhouding tussen beide pieken: \(1,25:\frac{1,00}{1,50}=0,67\)

Door deze correctie kunnen we de oppervlakten gelijk stellen aan de concentraties, en dat wil zeggen dat de concentratie stof A in het monster dus \({1,25\over0,67}=1,87\) keer zo groot is als de interne standaard. De concentratie van stof A is dus: 1,87·10–3 M.

Tweede aanpak:
De eerste aanpak is over het algemeen goed te volgen voor leerlingen en bevordert het conceptueel denken. De tweede methode is gebruik maken van een formule:

\({A_A\over c_A}=F{A_S\over c_S}\)

Hierin is A de oppervlakte (area) van de piek, c is de concentratie van de stof en F is de relatieve responsfactor.

Als eerste wordt met behulp van het tweede chromatogram (alle concentraties bekend) de relatieve responsfactor bepaald:

\({1,00\over 1,0\cdot10^{-2}}=F{1,50\over 1,0\cdot10^{-2}}\implies F=0,667\)

Daarna kan de bekende F gebruikt worden om de onbekende concentratie van stof A in het monster te bepalen:

\({1,25\over c_A}=0,667{1,00\over 1,0\cdot 10^{-3}} \implies c_A=1,87\cdot 10^{-3}\)

Standaardadditie

Een simpele ijklijn kan er als volgt uitzien:

Concentratie Meting
0 0
2,0·10–2 0,098
4,0·10–2 0,154
6,0·10–2 0,234
8,0·10–2 0,301
10,0·10–2 0,334

 

Als er nu een monster gemeten wordt op 0,281 dan kan met behulp van de ijklijn (en bijbehorende formule) uitgerekend worden wat de concentratie van stof A is. 

Dit is een heel beproefde methode die goed werkt op middelbare scholen en op allerlei situaties toegepast kan worden. Het probleem met de methode is dat in het monster vaak meer stoffen aanwezig zijn dan alleen stof A. Al deze andere stoffen kunnen ook bijdrage aan de meting die gedaan wordt. Hierdoor wordt niet alleen het effect van stof A gemeten, maar ook de andere stoffen. Dit is het zogenaamde matrix-effect.

Om dit te voorkomen moet de ijkreeks gemaakt worden met oplossingen die zoveel mogelijk op het monster lijken (en waarin eigenlijk alleen de hoeveelheid stof A variëert). Dit is erg lastig omdat vaak niet eens bekend is welke stoffen (en in welke concentraties) de matrix bevat. Als er voldoende monster is kan gekozen worden voor de standaardadditie methode. Wat er dan gebeurt is dat de ijkoplossingen gemaakt worden door aan het monster extra stof A toe te voegen. De ijkreeks ziet er dan bijvoorbeeld als volgt uit:

Toegevoegd A aan monster Meting
0  0,262
2 0,360
4 0,416
6 0,496
8 0,563
10 0,596

Er is dan steeds aan het monster een extra hoeveelheid stof A toegevoegd. Het monster hoeft dan daarna ook niet meer opnieuw gemeten te worden. De eerste meting is namelijk het monster zonder toegevoegde A. 

Om nu te bepalen hoeveel stof A er aanwezig was kan de grafiek als volgt gebruikt worden:

Op de x-as van de grafiek staat de hoeveelheid toegevoegde stof A. In het negatieve gedeelte van de x-as is dat dus de hoeveelheid verwijderde stof A. Als de meting waarde 0 oplevert dan is alle stof A verwijderd uit het monster. De invloed van de overige stoffen wordt hiermee teniet gedaan op de metingen. Door het doortrekken van de grafiek naar het negatieve gebied en het snijpunt met de x-as te bepalen is de hoeveelheid stof A te bepalen in het monster.

 

UV-VIS Spectroscopie

Ultraviolet licht en visueel licht spectroscopie wordt veel gebruikt als het gaat om kwantitatieve analyses van bepaalde stoffen. Kern van deze vorm van spectroscopie is: "hoe donkerder de oplossing, hoe meer stof erin zit". 

In dit hoofdstuk bekijken we de principes achter UV-VIS spectroscopie en kijken we hoe de wet van Lambert-Beer hierop toegepast kan worden. 

Spectroscopie - Algemeen

Alle spectroscopische technieken gaan over de interactie van elektromagnetische straling en een bepaalde stof. Vaak een zuivere stof, zodat de interactie ook gebruikt kan worden om een kwantitatieve uitspraak te doen. Er zijn een aantal spectroscopische technieken veelgebruikt:

  • UV-VIS spectroscopie, waarbij gebruikt gemaakt wordt van het vermogen van een stof om elektromagnetische straling te absorberen. 
  • IR spectroscopie, waarbij de relatief lage energetische straling er alleen voor zorgt dat een deeltje gaat trillen en/of roteren. Hierdoor is IR spectroscopie goed geschikt ter karakterisatie van een stof, en minder voor kwantitatieve bepalingen.
  • Massaspectroscopie (MS), waarbij deeltjes met elektronen worden beschoten, uit elkaar vallen en de fragmenten worden geanalyseerd. Deze techniek is zowel kwalitatief als kwantitatief bruikbaar.
  • Nucleaire Magnetische Resonantie (NMR) spectroscopie, waarbij radiogolven gebruikt worden om de kernspin van diverse atomen te richten en te veranderen. Deze techniek is uitermate geschikt voor karakterisatie van tal van organische verbindingen.

UV-VIS metingen

Alle gekleurde stoffen absorberen licht, vaak ook in oplossing. In het zichtbare lichtspectrum kan een zogenaamd absorptiespectrum gemeten worden. Voor chlorofiel A en B (de groene kleurstof in planten) ziet het absorptiespectrum er als volgt uit:

Hiernaast is duidelijk te zien dat chlorofiel vooral absorbeert in het blauwe en rode gebied. Dit zorgt ervoor dat de stoffen groen licht weerkaatsen (en wij de stof dus waarnemen als groen.

 

 

Voor kwantitatieve bepalingen is het van belang dat de stof zo zuiver mogelijk is. In een mengsel van bijvoorbeeld beide soorten chlorofiel bij een golflengte van 650 nm (oranje) zullen beide stoffen licht absorberen. De mate waarin dit gebeurt is dus dankzij beide stoffen, en het is dus niet mogelijk om kwantitatief een uitspraak te doen over de hoeveelheid van één van beide stoffen. Hiervoor zijn meer metingen nodig, of moet de stof gezuiverd worden.

Voor kwantitatieve bepalingen wordt meestal gebruik gemaakt van een zuivere oplossing en wordt er steeds gemeten bij één bepaalde golflengte, namelijk die waarbij de stof maximaal licht absorbeert.

De meting vindt dan als volgt plaats:

Licht valt op een monochromator waardoor er één bepaalde golflengte licht ontstaat (waarbij gemeten wordt). De intensiteit van het licht voor het door de monsteroplossing gaat is \(I_0\), daarna wordt een deel van het licht geabsorbeerd door het monster (afhankelijk van hoeveel stof er aanwezig is). De intensiteit van het licht na het cuvet noemen we \(I\). Vervolgens valt het licht op een photoresistor en wordt de intensiteit van het licht omgezet in een absorptie. Een aantal grootheden binnen de UV-VIS spectroscopie:

Transmissie: \(T={I\over I_0}\)

Extinctie: \(E=-\log T\)

Beer's Law Lab
Click to Run

 

Lambert-Beer

Er is een verband tussen de hoeveelheid stof en de hoeveelheid licht de geabsorbeerd wordt. Een kwantitatieve uitspraak over concentratie kan op verschillende manieren gedaan worden:

  • Door een ijkreeks te maken (al dan niet met standaard-additie), op deze manier kan de absorptie die het apparaat meet direct gekoppeld worden aan de concentratie.
  • Als het apparaat de daadwerkelijke absorptie meet (soms gelijk aan extinctie, soms gelijk aan \(1-T\)), dan kan gebruik gemaakt worden van de wet van Lambert-Beer.

De wet van Lambert-Beer is als volgt:

\(E=\epsilon \cdot c\cdot l\)

Hierin is \(\epsilon\) de molaire extinctiecoëfficiënt (in \(L\over mol\cdot cm\)), \(c\) is de concentratie (in \(mol \over L\)) en \(l\) is de weglengte van de lichtweg door het monster, in vrijwel alle standaardcuvetten is dit \(1,0\text{ } cm\).

 

Extincties optellen

Zijn er desondanks meerdere stoffen aanwezig in het monster dan is het mogelijk om de extincties op te tellen. Door dan bij verschillende golflengtes te meten is het alsnog mogelijk om de concentraties te bepalen. 

Stel dat een mengsel componenten A en B bevat (met concentraties \(c_A\) en \(c_B\)) en er wordt bij twee verschillende golflengtes (1 en 2) gemeten. Dan is de totale extinctie bij golflengte 1:

\(E_1=E_{A,1}+E_{B,1}=\epsilon_{A,1} c_A l +\epsilon_{B,1} c_B l \)

Bij golflengte 2 geldt:

\(E_2=E_{A,2}+E_{B,2}=\epsilon_{A,2} c_A l +\epsilon_{B,2} c_B l \)

Beide extincties: \(E_1 \) en \(E_2\), worden gemeten, alle molaire extinctiecoëfficieënten zijn bekend en de weglengte is ook overal gelijk. Dit levert twee vergelijkingen met als enige onbekenden  \(c_A\) en \(c_B\), dus een oplosbaar stelsel van vergelijkingen. De concentraties kunnen nu berekend worden.

Beperkingen van UV-VIS

UV-VIS spectroscopie heeft zijn beperkingen:

  • De wet gaat uit van een lineair verband, echter bij hoge concentraties is er niet langer een lineair verband, de extinctie stijgt niet langer lineair bij hoge concentraties maar zal minder stijl toenemen. Deze afwijking is fundamenteel en het gevolg van intermoleculaire interacties tussen analyt moleculen. Hoge concentraties in deze context zijn al concentraties boven 0,01 M. 
    De hoge concentratie deeltjes leidt ertoe dat deeltjes elkaars ladingsverdeling gaan beïnvloeden, hierdoor verandert het absorptievermogen van elektromagnetische straling. Dit is ook mogelijk door interacties tussen analyt moleculen en oplosmiddel. Waterstofbruggen kunnen hierbij ook een rol spelen. 
  • Instrumenteel kunnen bepaalde beperkingen leiden tot licht dat niet monochromatisch is, maar ook strooilicht van de omgeving kunnen de meting beïnvloeden.
  • Analyten die in waterige oplossing een evenwicht vormen (doordat ze als zwak zuur of zwakke base reageren), kunnen ook niet altijd nauwkeurig bepaald worden. Zo kan het zijn dat slechts één van beide deeltjes licht absorbeert of dat beide deeltjes juist licht absorbeert. De concentratie kan niet meer goed betrouwbaar bepaald worden met een ijklijn.

 

Infrarood Spectroscopie - IR

Infrarood spectroscopie onderscheidt zich van UV-VIS spectroscopie doordat de elektromagnetische straling niet geabsorbeerd wordt doordat er interactie met elektronen plaatsvindt, maar met hele moleculen. De moleculen gaan door opname van IR-licht (warmte) trillen en bewegen.

Afhankelijk van de golflengte van het IR-licht dat op een molecuul valt zal een bepaalde vibratie of rotatie gestimuleerd worden. En vindt er excitatie plaats van bepaalde trillingen.

IR-spectroscopie is vooral geschikt om in organische moleculen bepaalde groepen of typen bindingen te herkennen.

 

IR-spectrum

Een IR-spectrum leest anders dan chromatogrammen of andere spectra. Hieronder staat het spectrum van azijnzuur:

Op de verticale as staat de "transmittance": de hoeveelheid elektromagnetische straling die doorgelaten wordt door het monster. Als deze één is: bij die hoeveelheid energie is er geen vibratie of rotatie in het molecuul die met de trilling van de elektromagnetische straling gaat resoneren.

Op de horizontale as staat het golfgetal, dit is historisch bepaald. Het golfgetal is simpel om te rekenen in frequenties, golflengtes en energieën.

 

Grootheid Eenheid
Golfgetal,  \(\tilde{v}\) Reciproke centimeter, cm-1
Golflengte, \(\lambda\) Centimeter, cm
Frequentie, \(f\) Hertz, Hz (s-1)
Energie, \(E \) Joule, J
Lichtsnelheid, \(c\) \(2,998\cdot10^{10} cm/s\)
Constante van Planck, \(h\) \(6,626\cdot10^{-34}m^2kg/s\)

 

Omrekenen gaat desgewenst als volgt:

Golfgetal: \(\tilde{v}=\frac{1}{\lambda}\)

Frequentie: \(f=\frac{c}{\lambda}=c\cdot\tilde{v}\)

Energie: \(E=h\cdot f\)

Belangrijk om in te zien (aan de hand van de formules) is de volgende redenatie:

Een groot golfgetal \(\to\) kleiner golflengte \(\to\) meer golven per afstand \(\to\) hogere frequentie \(\to\) dus een hogere energie.

Wiskundig is dit ook af te leiden uit bovenstaande formules:

\(E= h\cdot c\cdot\tilde{v}\)

 

Moleculair niveau

Alle moleculen trillen, bewegen en draaien. In de scheikunde worden dit rotationele, translationele en vibrationele bewegingen genoemd. Een molecuul met 4 atomen (bijvoorbeeld ammoniak) heeft 3 x 4 = 12 verschillende coördinaten nodig om het molecuul volledig vast te leggen. Namelijk een x, y en z coördinaat voor ieder atoom. Immers, alle atomen kunnen ten opzichte van elkaar ook bewegen, de binding is niet star.

De 12 coördinaten voor ammoniak noemen we vrijheidsgraden. Omdat we het molecuul in de ruimte aanduiden op een bepaalde locatie gebruiken we hiervoor 3 vrijheidsgraden (de translationele bewegingen), daarnaast gebruiken we 3 vrijheidsgraden om de rotatie (om drie mogelijke assen) aan te duiden. Dan zijn er nog 6 vrijheidsgraden over die in het geval van ammoniak overeenkomen met de 6 mogelijke vibraties. In alle gevallen van een molecuul met N atomen zijn er 3N-6 mogelijke vibrationele toestanden.

Vibraties ammoniak

Elk van de vibraties komt overeen met een bepaald golfgetal (energie). Als deze trillingen een verandering in dipoolmoment van het molecuul met zich meebrengen dan zal deze vibratie interactie aan kunnen gaan met elektromagnetische straling die dezelfde frequentie heeft (in het IR-gebied). De natuurlijke vibratie van het molecuul wordt "aangeslagen" en krijgt een grotere amplitude, deze extra energie gaat uiteindelijk weer verloren in de vorm van warmte.

De mogelijke vibraties van een molecuul zijn te verdelen op verschillende manieren:

  • Strekvibraties en buigvibraties, bij strekvibraties veranderen bindingslengtes en bij buigvibraties veranderen bindingshoeken. 
  • Symmetrische en asymmetrische vibraties. Bij symmetrische vibraties is het mogelijk dat het dipoolmoment van het molecuul niet verandert, en er dus bij de bijbehorende energie van deze vibratie in het IR-spectrum geen piek (lagere transmissie) te zien is. 

 

Beschrijvend model

Om een beschrijving te geven van de vibraties, en bijbehorende frequenties wordt vaak een beschrijvend model vanuit de klassieke mechanica gebruikt. 
Een binding tussen atomen wordt in die zin gezien als een veer met een bepaalde harmonische trilling (oscillatie). Door gebruik te maken van de wet van Hooke (veer-wet) kunnen we de trilling beschrijven.

De wet van Hooke zegt dat de mate van uitrekking van een veer proportioneel is met de kracht die daar voor nodig is:

\(F=-k\cdot x\)

Van hieruit kan met behulp van de tweede wet van Newton, en een tweede orde differentiaalvergelijking de frequentie van de harmonische trilling afgeleid (zie ook hier) worden:

\(f=\frac{1}{2\pi}\cdot\sqrt{\frac{k}{m}}\)

 

Vertaling naar atomen

Om de harmonische trilling toe te passen op atomen doen we twee aanpassingen aan de formule voor een harmonische trilling:

  • Ten eerste gaan we de gereduceerde massa gebruiken, het gaat immers niet meer om een veer aan een muur maar om een atoom gebonden (met een "veer") aan een ander deeltje dat ook kan bewegen.
    De gereduceerde massa is:
    \(\mu=\frac{m_1m_2}{m_1+m_2}\)
  • Ten tweede is het eenvoudiger om het golfgetal te gebruiken voor IR spectra, dus we vermenigvuldigen met \(c\) om het golfgetal te krijgen.

De vergelijking is dan:

\(\tilde{v}=\frac{1}{2\pi c}\cdot\sqrt{\frac{k}{\mu}}\)

In deze vergelijking kunnen we zien dat het golfgetal afhankelijk is van slechts twee factoren:

  • De sterkte van de binding (sterkte van de "veer"), \(k\). Als een binding tussen atomen sterker is, dan zal er meer energie nodig zijn om de de binding te laten trillen, en zal de binding met een hogere frequentie trillen. Het golfgetal zal dan hoger zijn van de betreffende binding.
  • De massa van beide atomen, \(\mu\). Als de massa van de atomen hoger wordt, dan zal de frequentie van de trilling afnemen, er is dan minder energie nodig om de trilling te laten plaatsvinden. Het golfgetal zal dan ook lager zijn. 

Omdat de sterkte van een binding vrijwel onafhankelijk is van in welke verbinding deze atoombinding voorkomt. Kunnen we voor een groot aantal vibraties aangeven waar we deze in een IR spectrum gaan verwachten.

PDF openen in nieuw tabblad

Verklaren IR-spectrum

Om een IR-spectrum goed te kunnen duiden is altijd een tabel nodig met bekende golfgetallen bij specifieke vibraties. Deze is in vrijwel alle bronnen te vinden (ook in Binas).

Grote moleculen kunnen in theorie veel pieken opleveren in IR-spectra. Een molecuul dat bestaat uit 10 atomen heeft 3 x 10 - 6 = 24 mogelijke vibraties (en dus potentiële pieken). Om een vibratie te kunnen zien moet door de vibratie het dipoolmoment veranderen van het molecuul. Dit verkleint het aantal pieken aanzienlijk. Daarnaast zijn er nog een aantal factoren die ook tot minder pieken kunnen leiden:

  • Vibraties met identieke energieën zullen een gelijk golfgetal hebben en elkaar overlappen in het spectrum.
  • De intensiteit van de trilling kan te laag zijn om waargenomen te kunnen worden in een IR-spectrum.
  • De energie van de trilling ligt buiten het detectiegebied van het IR-apparaat.

Hier rechts staat het spectrum van ethanol in de gasfase. Hier zijn een aantal pieken te zien onder de 1500 cm-1 (rechts daarvan). Deze pieken vallen in het zogenaamde "fingerprint" gebied. Dit wordt zo genoemd omdat de pieken daar moeilijker te karakteriseren zijn, maar wel een unieke vingerafdruk geven van de verbinding in kwestie. Dat gebied kan uitstekend vergeleken worden met spectra van bekende stoffen ter controle.

Er zijn twee duidelijke pieken voor ethanol zichtbaar:

  • ~3000 cm-1, deze piek is afkomstig van de C-H strekvibratie in het ethanolmolecuul.
  • ~3700 cm-1, deze piek licht erg ver links, dat wil zeggen een hoge bindingsterke en/of lage massa. In dit geval is dat de O-H strekvibratie.

De C-O strekvibratie rond de 1100 cm-1 is ook nog herkenbaar in het spectrum.

Hiernaast is nogmaals het spectrum van ethanol weergegeven, nu is het ethanolmolecuul echter niet in de gasfase (zoals hierboven het geval is) maar in de oplossing gemeten.

Wat opvalt is de ontzettend brede piek rond 3300 cm-1. Dit is de verbreding van de O-H strekvibratie als gevolg van het vormen van waterstofbruggen.

Een waterstofbrug verzwakt de O-H binding, een zwakkere binding levert een piek bij een lager golfgetal. Maar omdat niet alle bindingen exact evenveel verzwakt worden zijn er eigenlijk zeer veel pieken aanwezig, waardoor het in essentie een zeer brede piek wordt. Deze verbreding is kenmerkend voor alle waterstofbrugvormende groepen (mits gemeten in oplossing).

Veel oefenmateriaal (ook voor MS en NMR) vind je op http://www.cheminfo.org/flavor/structuralAnalysis/index.html 

Hydrogen Deficiency Index, HDI (Onverzadigdheidsindex)

De HDI is een goed hulpmiddel voor het ophelderen van organische structuren als de molecuulformule al bekend is. De HDI geeft dan aan hoeveel pi-bindingen en/of ringstructuren er zijn in een molecuul.

HDI = 1/2 x ( 2 C + 2 + N - H - X)

Voorbeeld:

C6H12O2

De HDI is 1/2 x (2x6 + 2 - 12) = 1

Er is dus maar één dubbele binding in dit molecuul. 

 

Atomaire Absorptie Spectroscopie (AAS)

Atomaire Absorptie Spectroscopie is een wat oudere techniek die veel gebruikt wordt voor kwantificatie van metalen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het feit dat atomen licht opnemen met een hele specifieke golflengte. 

Werking - algemeen

In een AAS wordt een monster opgezogen en in een vlam verbrand. Door het verbranden van het monster komen de atomen vrijwel los in de vlam. Deze atomen kunnen licht van een heel specifieke golflengte opnemen in de vlam. Door de vlam schijnt licht met exact diezelfde golflengte, hiervan wordt dus een groot gedeelte geabsorbeerd. De mate van absorptie zegt iets over de concentratie. 

Er zijn echter nogal wat storende factoren die van invloed kunnen zijn op de metingen in een AAS.

Vergelijkbare technieken

AAS is inmiddels een wat verouderde techniek die inmiddels vervangen is door technieken als AES en ICP-OES. 

Atomaire Emissie Spectroscopie (AES)
Is erg vergelijkbaar met AAS, alleen maakt gebruik van de emissie van straling door de atomen in een vlam. Er is geen lamp nodig, wat de techniek een stuk goedkoper maakt. Daarnaast is de techniek ook goed voor het bepalen van concentraties van aardalkalimetalen (die met AAS minder goed te bepalen zijn). 

Inductive Coupled Plasma - Optic Emission Spectroscopy (ICP-OES)
Deze techniek is het mooist in de zin dat deze alle atoomsoorten tegelijk kan bepalen. Een monster wordt vernevelt en in een plasma gebracht. De straling van het plasma valt op een detector en wordt door een computer geanalyseerd. Door de intensiteit van de straling te combineren met de golflengtes kan in een korte tijd de samenstelling van een monster bepaald worden. Daarnaast is de detectiegrens van een ICP-OES veel lager dan AAS en AES. 

 

Verstoringen

De absorptie van licht in een AAS is afhankelijk van vele factoren:

  • Er zijn niet veel atomen in de vlam waardoor de gevoeligheid relatief laag is. 
  • De brandstof die gebruikt wordt voor de vlam is van invloed.
  • De volledigheid van de verbranding (zuurstof/brandstof verhouding).
  • De aanwezigheid van metaaloxiden, deze zijn erg stabiel waardoor deze niet gemeten wordt.
  • Interferentie door emissie van straling door de metaaldeeltjes in plaats van absorptie. Deze emissie draagt bij aan de intensiteit van het licht dat op de detector valt.
  • Aanwezigheid van andere atomen met absorptiegebieden die in de buurt van het absorptiegebied van het analyt vallen. 
  • Mogelijke aanwezigheid van niet vluchtige zouten (sulfaten en fosfaten). 

Gelukkig is een deel van deze zaken te ondervangen door aanpassingen aan de methodes en apparatuur. 

 

Nucleaire Magnetische Resonantie - NMR

Een van de favoriete technieken van organisch chemici om organische verbindingen te karakteriseren. In deze sectie gaan we kijken naar hoe een NMR spectrum tot stand komt en hoe het spectrum geïnterpreteerd hoort te worden.

Er zijn weinig boeken die NMR goed uitleggen, een zeer goede alternatieve bron is het website van de Khan Academy (https://www.khanacademy.org/science/organic-chemistry/spectroscopy-jay/proton-nmr/v/introduction-to-proton-nmr). Dit zijn toegankelijke en duidelijke filmpjes die alle benodigde stof voor dit vak helder uitleggen.

Een goede bron voor oefenmateriaal en het simuleren van NMR-spectra is onderstaande link.

http://nmrdb.org

Extra uitleg over NMR

Oorsprong ontstaan spectrum

In goed Nederlands: kernspinresonantie. In grote lijnen is dat ook precies wat er gebeurd. Een spin van een proton levert een magnetisch veld op, door resonantie van dit magnetisch veld wordt een signaal uitgezonden dat na interactie opgevangen wordt en geplot wordt in een NMR spectrum. De omgeving van een kern bepaalt de plaats van een piek in een NMR spectrum.

De spin van een atoomkern wordt op quantumniveau bepaald door de spin van de aanwezige quarks. Een atoomkern met een even aantal protonen en oneven aantal neutronen (of andersom) heeft een netto kernspin van 1/2 (een half-integere waarde). De meest voorkomende isotopen waarbij dit het geval is zijn 1H, 13C, 19F en 31P. De waterstofisotoop is de meest voorkomende en komt in vrijwel alle organische verbindingen voor. We zullen ons daarom focussen op de waterstofkernen.

Doordat een waterstofkern een netto spin heeft, ontstaat er een magnetisch moment (vector, zie rechts). 

Als er dan een extern magneetveld, B0, wordt aangelegd dan zijn er twee opties voor de kern:

 

Een \(\alpha\) optie, die energetisch het meest gunstig is, waarbij het magnetisch moment van de kern gelijk gericht is met het magnetisch veld dat extern op de kern wordt gelegd. 

Een \(\beta\) optie, met hogere energie, waarbij het magnetisch veld van de kern tegengesteld is aan het extern aangelegde magnetische veld. 

Vrijwel alle kernen bevinden zich in de \(\alpha\) toestand. Door een radiofrequente puls naar de kern te sturen kan de spin van de kern omdraaien waardoor deze zich in de \(\beta\) toestand zal bevinden. er is energie nodig om een kern van de \(\alpha\) naar de \(\beta \) toestand te krijgen. Deze energie wordt geleverd door de puls met radiogolven. 

Het energieverschil tussen de  \(\alpha\) en  \(\beta \) toestand is afhankelijk van het externe magnetische veld. Een groter extern veld, betekent ook een groter energieverschil tussen beide toestanden (en dus een sterkere - hoger frequente - radiopuls die nodig is om een kern in "aangeslagen" toestand te krijgen. 

Door relaxatie van de kern, waarbij de  \(\beta \) toestand weer overgaat naar de  \(\alpha\) toestand komt er een radiosignaal vrij dat gedetecteerd wordt door de NMR. Dit ontvangen radiosignaal wordt omgezet in een bijbehorende piek op het NMR spectrum.

 

Bovenstaande geldt voor alle protonen en zou voor ieder proton (bij een vast extern veld) een gelijk signaal geven. Dit zou de techniek onbruikbaar maken. 

Shielding

Gelukkig is er een shielding effect door de omgeving van het proton. Als we naar één waterstofatoom kijken, dan zit daar een elektron omheen. Dit elektron genereert in dat externe magneetveld zijn eigen geïnduceerde magneetveld.

Het geinduceerde magneetveld van het elektron heft een deel van het externe magneetveld op. Het overgebleven veld, Beff, is het magneetveld zoals het proton dat daadwerkelijk ervaart. En zoals we eerder gezien hebben, de sterkte van het magneetveld is bepalend voor het energieverschil tussen de \(\alpha\) en \(\beta\) toestanden. Daarmee verkleint de aanwezigheid van het elektron het externe magneetveld, en is het energieverschil tussen beide toestanden kleiner.

 

Signalen in NMR spectrum

Doordat de hoeveelheid elektronen in de buurt van ieder proton vaak net even anders is voor ieder waterstofatoom in een molecuul zal ieder waterstofatoom in een molecuul zijn eigen signaal geven. 

Een chemisch equivalent waterstofatoom zal een vergelijkbaar signaal geven:

Bijzondere gevallen zijn die van verbindingen met dubbele bindingen en optische isomeren. 

  • Waterstofatomen bij dubbele bindinge kunnen ook verschillende signalen geven. 
    In onderstaande voorbeeld hebben de waterstofatomen steeds een verschillend signaal. Voorwaarde is wel dat de overige groepen verschillend zijn. Als dat dezelfde groepen zijn is de omgeving van beide protonen steeds elektronisch equivalent en leveren ze alsnog hetzelfde signaal.

Voorbeeld

Het spectrum van etheen, levert slechts één signaal op. Het spectrum van propeen daarentegen levert daarentegen vier verschillende signalen op.

 

  • In het geval van optisch actieve stoffen zijn waterstofatomen die vlak naast de optisch actieve groep zitten niet equivalent. De CH2 waterstofatomen in fenylalanine zitten net naast het optisch actieve koolstofatoom. Hierdoor leveren ze in theorie een ander signaal op. In de praktijk zal dit een zeer vergelijkbaar signaal zijn wat nauwelijks te onderscheiden is.

De plaats van de signalen in een spectrum wordt bepaald door de energieafstand tussen de \(\alpha\) en \(\beta\)toestand. In een NMR spectrum wordt hiervoor de chemical shift (\(\delta\)) gebruikt. De verschuiving van de frequentie (en dus energie) ten opzichte van een referentie.

De referentiestof is tetramethylsilaan, TMS (zie rechts). Dit molecuul geeft één signaal in een spectrum. Het elektropositieve silicium atoom stuwt elektronen in de richting van de methylgroepen. Hierdoor worden de waterstofkernen in grote mate voorzien van shielding. Een grote shielding levert een klein energieverschil in spin-toestanden op en daardoor kunnen we verwachten dat het signaal een relatief lage frequentie oplevert.

Alle andere stoffen worden gemeten t.o.v. TMS en hebben vrijwel allemaal een grotere chemische shift.

In bovenstaande afbeelding is te zien dat NMR spectra om historische redenen altijd omgekeerd weergegeven worden (x as is omgedraaid).

Belangrijk om in te zien:

  • Een proton dat weinig shielding (of zelfs deshielding) ondergaat zal een groter verschil hebben tussen de spin-toestanden (het geïnduceerde magneetveld is klein). Hierdoor is er meer energie nodig om de spin-toestand van het proton om te draaien. Bij een hogere energie hoort een hogere frequentie. En een hogere frequentie leidt tot een grotere chemische shift.
  • De grootte van een piek (piekoppervlakte) geeft bij NMR spectra aan hoeveel protonen verantwoordelijk zijn voor dat signaal. In onderstaande afbeelding is te zien dat de piekintegraal ons de verhouding tussen de pieken verteld (2,5 : 1 : 1,5 ofwel 5 : 2 : 3, wat overeenkomt met de 10 protonen die we zouden moeten zien).

Ook voor NMR spectra zijn er vele tabellen die aangeven bij welke chemische shift je wat voor type protonen ongeveer kunt verwachten.

 

PDF openen in nieuw tabblad

Spin-spin koppeling

In het eerdere spectrum van methanol zagen we twee signalen. Echter, er treedt een fenomeen op dat spin-spin koppeling heet. Hierdoor worden signalen gesplitst in meerdere kleine signalen.

Het externe magnetische veld wordt beïnvloed door de shielding van naburige elektronen, waardoor het effectieve magnetische veld lager wordt. Maar ook de naburige protonen met hun eigen magnetische veld kunnen het effectieve magnetische veld dat een proton voelt beïnvloeden.

We nemen als voorbeeld de verbinding hiernaast. Het linkse blauwe proton voelt ook de effecten van het magnetische moment van het rechtse rode proton. Er zijn dan twee opties:

 

Het rode proton heeft dus twee afzonderlijke signalen omdat het twee verschillende groottes van Beff zal ervaren (afhankelijk van de toestand van de spin van het blauwe proton).

Het signaal wat we verwachten is dus opgesplitst in kleinere signalen. Als er meerdere buren zijn dan zal deze interactie nogmaals plaatsvinden waardoor er steeds complexere signalen ontstaan:

  • Heeft een proton géén buren, dan is er één signaal, en noemen we dat een singlet.
  • Als een proton één buur heeft, is het signaal in twee kleinere gesplitst en noemen we dat een doublet.
  • Bij twee buren, splitst het signaal eigenlijk in vier kleine signalen, maar is er overlap tussen twee waardoor er drie signalen zichtbaar zijn (waarbij het middelste signaal de grootste intensiteit heeft). 
  • Als een proton drie buren heeft dan splitst het signaal in een kwartet, een groepje van vier signalen die bij elkaar horen. 

Algemeen geldt dat als er n buren zijn, er n+1 signalen zullen ontstaan. Het spectrum van methanol wordt dan:

Een aantal punten van aandacht:

  • "Buren" zijn protonen op maximaal drie bindingen afstand. 
  • Chemisch equivalente protonen worden niet als buren beschouwd, de drie protonen van de CH3 groep van methanol voelen met zijn drieën alleen het effect van het proton van de OH-groep, hierdoor splitst het signaal van de drie H's in een doublet.
  • Omdat protonen in een OH groep een zuur karakter hebben, kunnen deze uitgewisseld worden met de deuteriumatomen die in het oplosmiddel (vaak gedeutereerd chloroform) aanwezig zijn. Het signaal van de OH groep verdwijnt dan omdat deuterium geen signaal geeft op een NMR. Ook de spin-spin koppeling die de OH-groep normaal zou geven voor andere protonen verdwijnt daarmee. Om het signaal van een zuur proton toch zichtbaar te maken wordt het spectrum vaak snel na oplossen genomen. 
  • Gekoppelde protonen hebben een koppelingsconstante (\(J\) in Hz) die bepaalt wat de afstand wordt tussen de pieken in een gesplitst signaal. 

Complexe splitsing

Sommige verbindingen leveren complexe splitsing van pieken op. We nemen de verbinding hier rechts als voorbeeld. Deze verbinding levert drie signalen op voor ieder van de drie aanwezige protonen. Het linkse en rechtse proton leveren allebei een doublet op, waarbij het rechtse (rode) proton minder shielding ervaart dan het linkse (groene) proton. Minder shielding wil zeggen een groter verschil tussen de spintoestanden en een grotere chemische shift. Het rode proton zal dus een doublet (vanwege het middelste - blauwe - proton als buurman) met een grote chemische shift opleveren. 

Het groene proton levert ook een doublet op met een kleinere chemische shift dan het rode proton. 

Het middelste (blauwe) proton is complexer. Het heeft twee buren, maar zal geen triplet opleveren. De koppelingsconstante voor beide mogelijke koppelingen is anders:

\(J_{blauw + rood}=6Hz \)

\(J_{blauw + groen}=4 Hz\)

Dit levert dan de splitsing op zoals hier rechts. Het blauwe proton levert een signaal op dat opgesplitst gaat worden, door het rode proton met een koppelingsconstante van 6 Hz. Het verkregen doublet wordt wederom opgesplitst in doublets door het groene proton met een koppelingsconstante van 4 Hz. 

Dit kan in sommige gevallen heel complexe splitsingspatronen opleveren. Benzeenringen met substituenten staan hiervoor bekend. Het verkregen signaal is zo complex opgesplitst dat dit vaak aangeduid wordt als multiplet. Vanwege de grote chemische shift van protonen aan een benzeenring zijn deze wel goed herkenbaar. 

 

 

Massaspectrometrie - MS

Massaspectrometrie is een techniek die zowel als karakterisatie als kwantificatie ingezet kan worden.

Vaak wordt een massaspectrometer gekopeld aan een gaschromatograaf. Een massaspectrometer is dan bedoeld als karakterisatie.

Massaspectrometrie van mengsels is ook mogelijk, mits er verschillende fragmenten ontstaan.

In essentie geldt voor massaspectrometrie dat dit het beschieten van verbindingen met elektronen is, waardoor de verbindingen uit elkaar vallen. Van de ontstane fragmenten wordt dan de massa bepaalt. De manier waarop een verbinding uit elkaar valt is karaktersitiek voor deze verbinding.

Een verbinding in een massaspectrometer doorloopt een aantal stappen:

  • Verdampen
  • Ioniseren
  • Fragmenteren
  • Versnellen
  • Afbuigen
  • Detecteren

Verdampen en ioniseren

Als eerste wordt de verbinding in de gasfase gebracht en vervolgens geïoniseerd.

Het ioniseren kan op verschillende manieren, twee veelgebruikte zijn:

Electron Impact Ionisatie (EI)

Hierbij wordt het monster gebombardeerd met elektronen afkomstig van een verwarmd filament direct in een vacuum. De elektronen schieten elektronen uit de verbinding waardoor er een geladen radicaal ontstaat.

Bij een willekeurig molecuul M gaat ionisatie als volgt:

M + e– → M•+ + 2 e–

Elektronen die het minst stevig aan het molecuul gebonden zijn, zullen als eerste uit het molecuul geschoten worden. Als eerste zullen dit elektronen uit niet-bindende elektroneparen zijn. Als die niet aanwezig zijn, dan worden elektronen in pi-bindingen uit het molecuul verwijderd. Tot slot worden elektronen uit sigma-bindingen verwijderd.

Door EI valt het geladen radicaal uit elkaar, er vindt fragmentatie plaats.

Elektronspray Ionisatie (ESI)

Een vloeistofstroom wordt hierbij onder elektrische spanning gezet onder atmosferische druk, hierin ontstaan de ionen. De vloeistof wordt direct in het vacuumgedeelte geinjecteerd waardoor de ionen uit de vloeistof versneld worden in de massaspectrometer.

Door gebruik te maken van deze techniek blijven de ontstane ionen intact. Hierdoor kunnen ook mengsel van bijvoorbeeld aminozuren goed geanalyseerd worden.

Fragmenteren

Als er een geladen radicaal is ontstaan kan dit gaan fragmenteren. Hiervoor zijn verschillende mogelijke mechanismen afhankelijk van welk deel van het molecuul geïoniseerd is.

We kunnen fragmentatie van verbindingen verdelen in homolytische en heterolytische fragmentatie.

 

Homolytische fragmentatie

Bij homolytische fragmentatie zal een binding in het molecuul homolytisch splitsen. Dit kan op verschillende manieren. Carbonylverbindingen ondergaan een mechanisme dat \(\alpha\)-cleavage heet:

Het ontstane ion zal zich verder door resonantie stabiliseren tot een carbokation.

Een vergelijkbaar proces gebeurt in halogeenalkanen:

 Een andere mogelijkheid tot het vormen van fragmenten in moleculen die groot genoeg zijn is een zogenaamde McLafferty omlegging (\(\beta\)-cleavage):

Het verschil tussen \(\alpha\) en \(\beta\)-cleavage is welke binding breekt gezien vanaf de carbonyl. Als het de eerste binding is dan spreken we over alpha-cleavage, is het de tweede binding dan noemen we dat beta-cleavage. Welk mechanisme de overhand heeft is moeilijk te voorspellen, in het geval van massaspectrometrie geldt vaak dat als beide kunnen plaatsvinden, beide ook daadwerkelijk plaatsvinden.

 

Heterolytische fragmentatie

Bij heterolytische splitsing gaan beide elektronen van een binding naar één atoom toe. Ethers ondergaan vaak het volgende splitsingsmechanisme:

 Maar ook halogeenalkanen kunnen een dergelijke splitsing ondergaan:

Algemeen

Vaak vinden diverse mechanismen tegelijkertijd plaats. Er zijn wel enkele richtlijnen die helpen:

  • Bindingen tussen koolstofatomen en een elektronegatiever atoom zullen bij voorkeur heterolytisch breken (waarbij de elektronen uiteraard naar het elektronegatieve atoom zullen verplaatsen).
  • Bindingen tussen atomen met vergelijkbare elektronegativiteiten zullen vaak homolytisch splitsen. 
  • Een zwakke binding zal sneller breken dan een sterke binding. 
  • Als het verbreken van een binding leidt tot de vorming van een stabiel (carbo)kation dan zal deze binding sneller breken.

Versnellen en afbuigen

Na ionisatie en fragmentatie worden de positief geladen fragmenten versneld in een elektrisch veld. Vervolgens komen de deeltjes in een magnetisch veld waardoor deze een Lorentz-kracht ondervinden. De afbuiging van deze deeltjes is afhankelijk van de massa (en snelheid en lading) van deze deeltjes. 

Fragmenten met een grote massa zullen minder goed afbuigen en dus op een andere plaats op de detector terecht komen.

De afbuiging kan prima natuurkundig beschreven worden. Zie het filmpje op de Khan Academy: https://www.khanacademy.org/science/in-in-class-12th-physics-india/moving-charges-and-magnetism/in-in-magnets-and-magnetic-force/v/mass-spectrometer

Detectie en massaspectrum

Als de deeltjes (afhankelijk van massa en lading) een bepaalde afbuiging ondergaan komen ze op diverse plaatsen op de detector. Een fragment-ion dat op de detector komt zal daar elektronen opnemen om neutraal te worden. Door het opnemen van elektronen gaat er een klein elektrisch stroompje lopen. Dit is het signaal dat de detector registreert.

Op verschillende manieren kan dan de detectie plaatsvinden bij andere massa's:

  • Door het verschuiven van de detector naar een andere positie, dit luistert erg nauw en gebeurt daarom vrijwel niet (meer).
  • Door het aanpassen van het magnetisch veld, hierdoor verandert ook de positie waarop de deeltjes terecht komen.

Met beide methoden kunnen alle zogenaamde m/z waarden gemeten worden. Zowel de massa als de lading (z) zijn van belang. Een grotere lading wil zeggen dat zelfs een zwaarder deeltje verder afgebogen kan worden dan een licht deeltje. Daarom wordt gebruik gemaakt van de m/z waarde.

Detectie van de hoeveelheid fragmenten (de intensiteit) bij een bepaalde m/z waarde kan zeer nauwkeurig. Zo lijken de verbindingen C9H14 en C8H10O vrijwel dezelfde massa te hebben, maar kunnen door hoge resolutie spectroscopie toch onderscheiden worden (massa's van 122,1096 u en 122,0732 u respectievelijk).

Meestal worden de m/z waarden als integere waarden beschouwt en dit levert dan spectrogrammen op zoals bijvoorbeeld hieronder:

In dit spectrum zijn verschillende pieken zichtbaar, een aantal daarvan komen in ieder massaspectrum terug:

  • Basis-piek: dit is de piek met de hoogste intensiteit, deze krijgt per definitie een intensiteit van 100, de overige pieken zijn hieraan gerelateerd. Deze piek is afkomstig van het fragment-ion dat het meeste voorkomt (en waarschijnlijk ontstaan is door het fragmentatie mechanisme met de grootste voorkeur).
  • Molecuul-ion-piek: dit is de piek die afkomstig is van het volledig intacte (maar wel geladen) molecuul. Dit is de piek met de "hoogste" m/z waarde. Voor ethanol is dat de piek bij m/z = 46.
  • M+1 piek: dit is de piek direct rechts naast de molecuul-ion-piek. Deze piek ontstaat doordat er een kans is dat één van de koolstofatomen in het molecuul geen C-12 maar een C-13 isotoop is.
    Deze piek is vaak zeer klein. Indien de intensiteit van de M+1 piek ten opzichte van de molecuul-ion-piek bekend is, kunnen deze intensiteiten gebruikt worden om het aantal koolstofatomen in een molecuul te berekenen.
  • Is de molecuul-ion-piek te vinden bij een oneven m/z waarde, dan is de kans vrij groot dat er een oneven aantal N-atomen in het molecuul aanwezig zijn.

Isotoopverhoudingen

Omdat een massaspectrometer isotopen detecteert kan deze ook gebruikt worden om aan te tonen wat de natuurlijke verhouding is van bepaalde isotopen. Het massaspectrum van zuiver boor ziet er als volgt uit:

De verhouding van B-10 en B-11 is duidelijk uit het spectrogram te halen: 25 : 100. Het percentage voorkomen in de natuur kan dan eenvoudig worden berekend, bijvoorbeeld voor B-10:

\(\frac{25}{(25+100)}\times100\%=20\%\)

Dit komt overeen met de waarden zoals deze in Binas getabelleerd staan.

Bij organische verbindingen die halogenen bevatten bevat het spectrum vaak meerdere molecuulpieken in een specifieke verhouding. Bij bijvoorbeeld 2-chloorpropaan:

Hier zijn twee pieken bij m/z = 78 en m/z = 80 te zien. En dus niet de gebruikelijke molecuulpiek en M+1 piek.

Een M+2 piek geeft in dit geval aan dat het molecuul een atoom bevat dat in de natuur voorkomt als twee isotopen (met een verschil van 2 u) en een verhouding van ongeveer 3 : 1. Dit komt prima overeen met de isotopen Cl-35 (75% voorkomen) en Cl-37 (25% voorkomen).

Let wel op dat als de molecuulmassa bekend is dat deze een relatieve molecuulmassa is (dus het gewogen gemiddelde van de voorkomende isotopen. Voor chloorpropaan dus 78,5 u.

  • Het arrangement Life Science Instrumentele Analyse is gemaakt met Wikiwijs van Kennisnet. Wikiwijs is hét onderwijsplatform waar je leermiddelen zoekt, maakt en deelt.

    Auteur
    Marcel van den Heuvel
    Laatst gewijzigd
    2021-08-27 09:34:06
    Licentie

    Dit lesmateriaal is gepubliceerd onder de Creative Commons Naamsvermelding 4.0 Internationale licentie. Dit houdt in dat je onder de voorwaarde van naamsvermelding vrij bent om:

    • het werk te delen - te kopiëren, te verspreiden en door te geven via elk medium of bestandsformaat
    • het werk te bewerken - te remixen, te veranderen en afgeleide werken te maken
    • voor alle doeleinden, inclusief commerciële doeleinden.

    Meer informatie over de CC Naamsvermelding 4.0 Internationale licentie.

    Aanvullende informatie over dit lesmateriaal

    Van dit lesmateriaal is de volgende aanvullende informatie beschikbaar:

    Toelichting
    Voor het vak Life Science ondersteunt deze wikewijs de theorie voor het voor het onderdeel analytische chemie. De werking van de diverse analyse technieken worden uitgelegd. Deze wiki kan zelfstandig gebruikt worden.
    Eindgebruiker
    leerling/student
    Moeilijkheidsgraad
    gemiddeld
    Studiebelasting
    4 uur 0 minuten

    Bronnen

    Bron Type
    Papierchromatografie
    https://www.youtube.com/watch?v=uOhefwQBAbI     		Video
    Dunnelaagchromatografie
    https://www.youtube.com/watch?v=-theAxYWO2o     		Video
    Animatie kolomchromatografie
    https://www.youtube.com/watch?v=9GiLjH9Oym8     		Video
    HAN - storten van een kolom
    https://www.youtube.com/watch?v=7CnfbTOn2Cc     		Video
    Vibraties ammoniak
    https://www.youtube.com/watch?v=aSiJ2bt1jwQ     		Video
    http://nmrdb.org
    http://nmrdb.org     		Link
    Extra uitleg over NMR
    https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/nmr/nmr1.htm     		Link

    Gebruikte Wikiwijs Arrangementen

    van der Vaart, Davy. (z.d.).

    Instrumentele Analyse

    https://maken.wikiwijs.nl/127383/Instrumentele_Analyse

  • Downloaden

    Het volledige arrangement is in de onderstaande formaten te downloaden.

    Metadata

    LTI

    Leeromgevingen die gebruik maken van LTI kunnen Wikiwijs arrangementen en toetsen afspelen en resultaten terugkoppelen. Hiervoor moet de leeromgeving wel bij Wikiwijs aangemeld zijn. Wil je gebruik maken van de LTI koppeling? Meld je aan via info@wikiwijs.nl met het verzoek om een LTI koppeling aan te gaan.

    Maak je al gebruik van LTI? Gebruik dan de onderstaande Launch URL’s.

    Arrangement

    IMSCC package

    Wil je de Launch URL’s niet los kopiëren, maar in één keer downloaden? Download dan de IMSCC package.

    Voor developers

    Wikiwijs lesmateriaal kan worden gebruikt in een externe leeromgeving. Er kunnen koppelingen worden gemaakt en het lesmateriaal kan op verschillende manieren worden geëxporteerd. Meer informatie hierover kun je vinden op onze Developers Wiki.

  • Gebruik
    Weergave
  • Wikiwijs is een dienst van