Als eerste wordt de verbinding in de gasfase gebracht en vervolgens geïoniseerd.
Het ioniseren kan op verschillende manieren, twee veelgebruikte zijn:
Electron Impact Ionisatie (EI)
Hierbij wordt het monster gebombardeerd met elektronen afkomstig van een verwarmd filament direct in een vacuum. De elektronen schieten elektronen uit de verbinding waardoor er een geladen radicaal ontstaat.
Bij een willekeurig molecuul M gaat ionisatie als volgt:
M + e– → M•+ + 2 e–
Elektronen die het minst stevig aan het molecuul gebonden zijn, zullen als eerste uit het molecuul geschoten worden. Als eerste zullen dit elektronen uit niet-bindende elektroneparen zijn. Als die niet aanwezig zijn, dan worden elektronen in pi-bindingen uit het molecuul verwijderd. Tot slot worden elektronen uit sigma-bindingen verwijderd.
Door EI valt het geladen radicaal uit elkaar, er vindt fragmentatie plaats.
Elektronspray Ionisatie (ESI)
Een vloeistofstroom wordt hierbij onder elektrische spanning gezet onder atmosferische druk, hierin ontstaan de ionen. De vloeistof wordt direct in het vacuumgedeelte geinjecteerd waardoor de ionen uit de vloeistof versneld worden in de massaspectrometer.
Door gebruik te maken van deze techniek blijven de ontstane ionen intact. Hierdoor kunnen ook mengsel van bijvoorbeeld aminozuren goed geanalyseerd worden.