Inleiding
Zestig jaar na de ontdekking van het DNA is het onderzoeksterrein enorm.
Er wordt DNA onderzoek gedaan in de biologische, chemische en medische sector en in de voedselindustrie. Ook in forensisch onderzoek en in afstammingsonderzoek is steeds meer mogelijk. Als dat onderzoek naar het genoom wordt wel samengevat onder de term genomics.
Het gebruiken van organismen als fabriek (evt. na genetische aanpassing) wordt biotechnologie genoemd.
DNA
 |
 |
DNA is vrij eenvoudig te isoleren.
Op school kun je bijvoorbeeld met een keukenmachine kiwipulp maken. Vervolgens is het een kwestie van de juiste oplosmiddelen kiezen om het DNA te isoleren.
Door het toepassen van verschillende technieken kan het DNA worden geknipt en geplakt en zelfs tussen verschillende soorten worden uitgewisseld.
DNA isoleren
Om DNA uit cellen te halen moeten de cellen worden opgebroken. Dat kan bijvoorbeeld door een soort zeep toe te voegen, waardoor de celmembraan uit elkaar valt en de inhoud van de cel vrijkomt.
Het DNA, RNA en de eiwitten worden minder oplosbaar gemaakt door zout toe te voegen. Eiwitten en RNA worden door toegevoegde enzymen afgebroken.
Door het mengen met ijskoude alcohol slaat het DNA neer. Het kan nu uit de oplossing worden gehaald.
DNA knippen en plakken
In de jaren 60 van de vorige eeuw ontdekte men enzymen in bacteriën die bepaalde volgorden in DNA herkennen en het DNA op die plaatsen in stukken knippen. Deze restrictie-enzymen zijn waarschijnlijk een bescherming tegen binnengedrongen virus-DNA.
Moleculair biologen maakten dankbaar gebruik van deze enzymen. Ze konden nu bepaalde DNA fragmenten uitknippen. De bacteriën bleken bovendien ook plak-enzymen te bezitten: ligases, waarmee de fragmenten weer aan elkaar kunnen worden gelijmd. Elk restrictie-enzym herkent een eigen specifieke nucleotidenvolgorde, meestal 4 tot 8 nucleotiden lang. Karakteristiek voor de sequentie is dat het een palindroom is: van links naar rechts of van rechts naar links gelezen dezelfde. Omdat bij iedere soort (zelfs bij ieder individu) de nucleotidevolgorde in het DNA uniek is, zullen restrictie-enzymen bij ieder individu een andere stukje uitknippen. Er ontstaan dus stukken DNA met een unieke sequentie en lengte. Uiteraard zijn er ook stukken met dezelfde lengte, als de DNA sequentie precies gelijk is op sommige plaatsen.
Vaak ontstaan bij het knippen enkelstrengs DNA stukken op de plaats van de knip. Deze delen, de sticky ends, maken het mogelijk een DNA fragment in een ander opengeknipt DNA molecuul in te “plakken”, zelfs in het DNA van een andere soort. Zo ontstaat recombinant DNA. (zie ook "Genetische modificatie")
DNA vermenigvuldigen
Na een misdrijf is er vaak maar een heel klein beetje DNA beschikbaar van bijvoorbeeld een haar, kleding of bloedvlek. Om forensisch onderzoek te kunnen doen, heb je meer DNA nodig. Dit kan door het DNA te vermenigvuldigen. De techniek om DNA te vermenigvuldigen heet PCR ofwel Polymerase Chain Reaction.
Voor een PCR worden de volgende componenten toegevoegd aan een oplossing met het te vermenigvuldigen DNA:
- primers. Een primer is een stukje enkelstrengs DNA van 20-30 nucleotiden, dat complementair is aan het gewenste te vermenigvuldigen stukje DNA.
- losse nucleotiden.
- DNA-polymerase dat geïsoleerd is uit bacteriën uit heetwaterbronnen en daardoor hittebestendig is.
Het proces gaat dan als volgt:
- Eerst worden de twee DNA strengen van elkaar gescheiden door een temperatuursverhoging tot ongeveer 95°C.
- Na afkoeling tot ongeveer 60°C bindt de primer. Een tweede primer past op het eind van de te vermenigvuldigen sequentie op de complementaire keten.
- De temperatuur wordt weer verhoogd, het DNA-polymerase gaat aan het werk en maakt uit de toegevoegde losse nucleotiden nieuwe strengen DNA erbij. Je hebt dan twee DNA moleculen gemaakt.
Wanneer deze cyclus van verhitten en afkoelen heel vaak wordt herhaald, komen er steeds meer DNA moleculen bij.
Stap 1
De DNA strengen worden verhit tot
ca. 95°C.
|
Stap 2
De temperatuur wordt verlaagd tot ca 50° - 68°C.
De primers kunnen bij deze temperatuur op de juiste plaatsen aan de DNA strengen gaan zitten.
|
Stap 3
De temperatuur wordt verhoogd tot ca 72°C. DNA-polymerase verlengt de ketens vanaf de primers in de 3' - 5' richting. De enkelstrengen worden dubbelstrengen.
|
Inbouwen in plasmiden
Elke bacterie heeft behalve een groot chromosoom ook nog kleine cirkelvormige DNA-moleculen, de plasmiden. Die plasmiden kunnen ze vrij gemakkelijk van de ene naar de andere bacterie overbrengen.
Wanneer je een ‘vreemd’ DNA-stukje in zo’n plasmide inbrengt, heeft dit geen effect op het vermenigvuldigen van het bacterie DNA bij de celdeling:
de bacterie zal de plasmide gewoon verdubbelen. Behalve het vermenigvuldigen van ‘vreemd’ DNA, kan de bacterie er ook toe aangezet worden om het vreemde DNA af te lezen en in eiwitten te vertalen. Alle nieuwe bacteriën hebben vervolgens deze eigenschap omdat ze door deling uit één cel zijn ontstaan.
We spreken van een kloon.
Wanneer DNA in cellen van een andere soort tot expressie komt, noemen we die soort transgeen.
Men spreekt van cisgeen als het ontvangende organisme wel van dezelfde soort is, maar bijv. van een ander ras.
Virus als vector
Virussen bouwen hun erfelijk materiaal in dat van de gastheer in.
Ze zijn daardoor geschikt om geselecteerd DNA in een gastheer in te bouwen. Daarvoor moeten wel eerst de ziekteveroorzakende genen uit het virus worden verwijderd. Daarna moeten en de gewenste genen (bijvoorbeeld het gen voor de productie van insuline) worden ingebouwd.
Belangrijk bij dit alles is dat de genen die het virus nodig heeft om de gastheer binnen te dringen, intact worden gelaten.
DNA vergelijken
 |
? Lengtes ongelijk
DNA uit sporen materiaal is met zekerheid niet van de verdachte. |
? Lengtes gelijk
Uit de verdeling van de STR-lengtes onder de bevolking volgt hoe groot de kans is dat twee verschillende personen dezelfde STR´s hebben. |
De technieken om het DNA van verschillende organismen met elkaar te vergelijken worden steeds nauwkeuriger.
Vandaar dat deze tests ook gebruikt worden bij onderzoek naar verwantschap of bij het opsporen van de dader van een misdrijf. Bedenk wel dat een DNA test nooit een bewijs kan zijn. Er is immers altijd een zeer kleine kans dat de DNA match toeval is. Bovendien zegt de aanwezigheid van DNA op een bepaalde plaats nog niets over de manier waarop het DNA daar is gekomen.
Gelelektroforese
Bij gelelektroforese worden de stukken DNA die bij PCR zijn gemaakt, zichtbaar gemaakt. Eerst wordt een gel gemaakt, waarin vervolgens het mengsel van DNA dat bij PCR gemaakt is wordt geïnjecteerd. Vervolgens wordt er elektrische spanning over de gel gezet. De stukken DNA bewegen dan van – naar +. De lange stukken zijn langzamer dan de korte stukken. Zo worden de stukken DNA van elkaar gescheiden.
Het zichtbaar maken van de DNA fragmenten gebeurt door middel van radioactieve nucleotiden of chemicaliën die aan het DNA binden.
DNA dat is gevonden op een slachtoffer kan zo worden vergeleken met het DNA van een verdachte.
Dezelfde techniek kan gebruikt worden om het DNA van een ziek en een gezond persoon te vergelijken en zo een erfelijke ziekte op te sporen.
DNA fingerprint
Als op het DNA van iemand een PCR wordt toegepast met bepaalde primers, ontstaan er stukken DNA van een bepaalde lengte. Deze stukken kunnen worden gescheiden door middel van elektroforese. Er ontstaat nu een analyse product dat voor ieder uniek is. Als dit unieke analyseproduct zichtbaar wordt gemaakt, krijg je een patroon van banden. Dit patroon noemt men wel een fingerprint, omdat het net zo uniek is als een vingerafdruk.
STR en SNP
99,9% van het DNA is bij alle mensen hetzelfde. Dat is ook wel begrijpelijk, natuurlijke selectie maakt dat in genen die coderen voor eiwitten niet veel variatie mogelijk is. Niet-coderende stukken DNA variëren echter van persoon tot persoon. Men noemt deze stukjes DNA polymorfismen (= veel vormen). Ongeveer 40 procent van het niet-coderende DNA bestaat uit zogenaamd repetitief DNA. Dat zijn korte DNA-sequenties van maximaal 60 basenparen lang die ettelijke keren herhaald worden. Zeer korte repetitieve sequenties
(2 tot 10) worden STR's (Short Tandem Repeats) genoemd. Voor verwantschapsonderzoek wordt meestal getest op dertien STR’s. De kans dat twee mensen hetzelfde profiel hebben is verwaarloosbaar klein.
SNP (Single nucleotide polymorfisme) uitgesproken als snip, is een basenpaar waarin bij tenminste één procent van de bevolking een bepaalde variatie in de nucleotide wordt gevonden. Bijvoorbeeld een verandering van AAGGCTAA naar ATGGCTAA. Binnen het menselijk genoom komen naar schatting 15 miljoen SNP's voor, ook in coderend DNA. Elk individu heeft een uniek patroon van SNP’s. Onderzoekers zijn geïnteresseerd in de mate waarin bepaalde SNP’s samenhangen met het voorkomen van een bepaalde ziekte of de gevoeligheid voor bepaalde medicijnen. Ook afstammingsonderzoek maakt gebruik van SNP’s.
|
? Wat is een SNP
SNP staat voor ´single nucleotide polymorphism´. Verschillende mensen kunnen een ander nucleotide hebben op bepaalde locaties in het genoom.
|
|
? Wat is een SNP-kaart
De locatie van talrijke SNP´s op een chromosoom.
|
|
? Wat kun je ermee
Kan worden gebruikt om de respons op medicijnen te voorspellen.
Tijdens de klinische studie
Patiënten met een doelmatige reactie zonder bijwerkingen op het geneesmiddel. Patiënten zonder doelmatige reactie of met ernstige bijwerkingen op het geneesmiddel.
Als het geneesmiddel op de markt is
SNP-profiel van deze patiënt voorspelt een veilige respons op het geneesmiddel. SNP-profiel van deze patiënt voorspelt een onveilige of weinig efficiënte respons op het geneesmiddel.
|
Sequencen
Om de exacte volgorde van de nucelotiden in een stuk DNA vast te stellen, maakt men gebruik van een techniek die sequencen heet.
Dat kan bijvoorbeeld door af te lezen welke basen er tijdens de speciale PCR-reactie worden ingebouwd. Daarvoor worden tijdens een PCR niet alleen gewone nucleotiden aan de reactie toegevoegd, maar ook nucleotiden die een 5'-OH-groep missen. Aan deze nucleotiden is bovendien een fluorescerende stof gebonden, met voor elke stikstofbase een eigen kleur. De DNA synthese stopt als zo’n nucleotide wordt ingebouwd, doordat de plek voor het hechten van een nieuw nucleotide (de OH-groep) ontbreekt. Door de replicatie te blijven herhalen, wordt uiteindelijk op elke plek in de DNA-sequentie een keer een fluorescerende nucleotide ingebouwd. Hierdoor ontstaan heel veel DNA-fragmenten, die elk 1 nucleotide in lengte verschillen.
Dat betekent dat elk DNA-fragment de kleur heeft van de laatst ingebouwde nucleotide. Door gelelektroforese worden de fragmenten gescheiden op lengte. Een detector leest vervolgens op volgorde alle kleuren af. Een stuk DNA met een lengte van 35 baseparen eindigend met een paarse ddNTP geeft aan dat er op de 35ste positie een C zat.
Tegenwoordig zijn er nieuwe technieken (Next Generation Sequencing) die dit allemaal sneller en goedkoper kunnen.
RFLP
Restrictiefragmenten lengte polymorfismen (RFLP).
Om verschillen tussen DNA monsters te bepalen kun je ook gebruik maken van restrictiefragmenten. Door inserties of deleties zijn bepaalde fragmenten langer of korter. Ook kunnen de knipplaatsen zijn gemuteerd, waardoor er heel andere fragmenten ontstaan. Met behulp van gelelektroforese kunnen de fragmenten worden gescheiden. Daarna worden ze met enzymen enkelstrengs gemaakt. Tenslotte wordt eenenkelstrengs radioactief test stukje DNA toegevoegd. Met radiografie wordt zichtbaar gemaakt waar een stukje test DNA is gebonden.
Restrictiefragmenten lengte polymorfismen
|
|
|
|
|
|
| Klik op de afbeeldingen om deze te vergroten |
DNA-microarray
DNA micro-array (DNA chip) wordt gebruikt om te bepalen welke genen worden afgelezen onder bepaalde condities.
Kleine stukjes DNA van de te onderzoeken genen worden vastgezet op een glasplaatje. Op zo’n DNA-chip passen wel duizend genfragmenten. De chip wordt verhit waardoor dubbelstrangs DNA enkelstrengs wordt. Uit de te onderzoeken cellen wordt al het mRNA geïsoleerd en met behulp van een enzym dat RNA omzet in DNA (reverse transcriptase) omgezet in copyDNA (cDNA). Het wordt bovendien voorzien van een gekleurde label. Hierna wordt het op de DNA chip gebracht.
Als mRNA aanwezig is dat precies op de DNA chip past, zal het aan een van de twee strengen hechten. Je weet dan welke genen op dat moment actief waren in je monster.
