Om de exacte volgorde van de nucelotiden in een stuk DNA vast te stellen, maakt men gebruik van een techniek die sequencen heet.
Dat kan bijvoorbeeld door af te lezen welke basen er tijdens de speciale PCR-reactie worden ingebouwd. Daarvoor worden tijdens een PCR niet alleen gewone nucleotiden aan de reactie toegevoegd, maar ook nucleotiden die een 5'-OH-groep missen. Aan deze nucleotiden is bovendien een fluorescerende stof gebonden, met voor elke stikstofbase een eigen kleur. De DNA synthese stopt als zo’n nucleotide wordt ingebouwd, doordat de plek voor het hechten van een nieuw nucleotide (de OH-groep) ontbreekt. Door de replicatie te blijven herhalen, wordt uiteindelijk op elke plek in de DNA-sequentie een keer een fluorescerende nucleotide ingebouwd. Hierdoor ontstaan heel veel DNA-fragmenten, die elk 1 nucleotide in lengte verschillen.
Dat betekent dat elk DNA-fragment de kleur heeft van de laatst ingebouwde nucleotide. Door gelelektroforese worden de fragmenten gescheiden op lengte. Een detector leest vervolgens op volgorde alle kleuren af. Een stuk DNA met een lengte van 35 baseparen eindigend met een paarse ddNTP geeft aan dat er op de 35ste positie een C zat.
Tegenwoordig zijn er nieuwe technieken (Next Generation Sequencing) die dit allemaal sneller en goedkoper kunnen.