Bronvermelding
Instituut voor Didactiek en Onderwijsontwikkeling Faculteit Wiskunde en Natuurwetenschappen is de beheerder van de rechten van dit arrangement.
Nijenborgh 9, 9747 AG Groningen
tel. 0503634365 / fax 0503634500
Inleiding
Bij papierelektroforese bewegen ionen onder invloed van een potentiaalverschil door een elektrolytoplossing die op een strook papier is aangebracht. Door elektroforese kunnen positief geladen deeltjes, negatief geladen deeltjes en ongeladen deeltjes van elkaar gescheiden worden.
Elektroforese kan o.a. toegepast worden op mengsels van aminozuren, omdat in een oplossing een aminozuurdeeltje, bij een bepaalde zuurgraad, een lading krijgt, afhankelijk van de in het aminozuur voorkomende karakteristieke groepen.
Zo vormt bv. alanine (2-aminopropaanzuur) bij pH = 6,1 in hoofdzaak dipolaire- of Zwitter-ionen:
Glutaminezuur (2-aminopentaandizuur) vormt bij pH = 6,1 negatieve deeltjes:
lysine (2,6-diaminohexaanzuur) vormt bij pH = 6,1 positieve deeltjes:
De lading van een deeltje wordt bepaald door de pKz waarden van de karakteristieke groepen (zie hieronder).
pKz1 pKz2 pKb1 pKb2
alanine 2,34 ---- 9,60 -----
glutaminezuur 2,19 4,25 9,67 -----
lysine 2,18 ---- 8,95 10,53
In een elektrisch veld bewegen de dipolaire- of Zwitter-ionen deeltjes niet, (ze zijn netto neutraal); als een deeltje netto negatief geladen is, gaan deze deeltjes gaan naar de + pool en de deeltjes die netto positief geladen zijn, gaan naar de - pool. De verplaatsing van de deeltjes kan zichtbaar gemaakt worden met een ninhydrine-oplossing.
Bij een pH van 1,6 komen de genoemde aminozuren alle drie voornamelijk als positief geladen:
De deeltjes bewegen dan allen naar de - pool. Dit gebeurt met verschillende snelheden omdat de snelheid van beweging afhangt van de lading, van de grootte en van de vorm van de deeltjes.
Op deze wijze kan door elektroforese de lading van aminozuurdeeltjes aangetoond worden; kunnen mengsels van aminozuren gescheiden worden en is eventueel het iso-elektrisch punt van een aminozuur te bepalen.
De scheiding van een mengsel van aminozuren
Benodigdheden
elektroforese-apparatuur
gelijkspanning 300 V
föhn
Whatman 1 - chromatografiepapier
twee roerstaafjes
pipetjes met nauwe opening
rubberhandschoenen
bekerglas 1000 mL
bekerglas 250 mL
3 bekerglazen 100 mL
4 maatcilinders 5 mL
2 maatcilinders 25 mL
2 maatcilinders 50 mL
maatcilinder 250 mL
maatcilinder 1000 mL
pH-meter
pH-elektrode
8 reageerbuizen
Chemicaliën
alanine
glutaminezuur
lysine
azijnzuur
mierezuur
natriumwaterstofcarbonaat
ninhydrine
aceton
bufferoplossing pH = 7,0
bufferoplossing pH = 4,0
bufferoplossing pH = 9,0
?
Voorbereidende werkzaamheden
- IJk de pH-elektrode
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=4,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 4,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 0 - 7 .
- Maak een oplossing met pH = 6,5
Neem een bekerglas van 1 L en voeg hierin: 5 mL azijnzuur en 850 mL gedestilleerd water. Homogeniseer.
Plaats de geijkte pH-elektrode in de oplossing en voeg met kleine schepjes zoveel natriumwaterstofcarbonaat toe te voegen tot pH = 6,5.
- Maak een oplossing met pH = 1,6
Neem een bekerglas van 500 mL en voeg hierin: 150 ml azijnzuur en 50 ml mierezuur. Homogeniseer.
Plaats de geijkte pH-elektrode in deze oplossing en controleer dat de pH van deze oplossing 1,6 is.
- Maken van een aminozuuroplossing met pH = 1,6
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine en 5 mL van de oplossing met pH = 1,6.
Schud het mengsel tot het aminozuur is opgelost. Homogeniseer.
Herhaal dit voor respectievelijk glutaminezuur en lysine.
- Maken van een aminozuuroplossing met pH = 6,5
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine en 5 mL van de oplossing met pH = 6,5.
Schud het mengsel tot het aminozuur is opgelost. Homogeniseer.
Herhaal dit voor respectievelijk glutaminezuur en lysine.
- Maak een oplossing met een mengsel van aminozuren met pH = 1,6
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine, 0,05 g glutaminezuur, 0,05 gram lysine en 5 mL van de oplossing met pH = 1,6.
Schud het mengsel tot de aminozuren zijn opgelost. Homogeniseer.
- Maak een oplossing met een mengsel van aminozuren met pH = 6,5
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine, 0,05 g glutaminezuur, 0,05 gram lysine en 5 mL van de oplossing met pH = 6,5.
Schud het mengsel tot de aminozuren zijn opgelost. Homogeniseer.
- Maak een ninhydrine oplossing
Neem een bekerglas van 100 mL en los 0,1 g ninhydrine op in 50 mL aceton.
Uitvoering
De elektroforese-apparatuur bestaat uit twee perspexbakjes (14 cm x 6 cm x 6 cm), bevestigd op een grondplaat elk voorzien van een 20 cm lange platina- draad (als elektrode) met aansluitklemmen. Als lijmmiddel kan chloroform gebruikt worden. Over de bakjes wordt een glasplaat (22 cm x 12 cm) gelegd. Bij gebruik moet als afscherming een plastic bak over het geheel worden geplaatst, zie tekening hierboven.
Vul de elektroforesebakjes voor ongeveer de helft met de oplossing met pH = 6,5.
Knip stroken elektroforesepapier van 10 cm x 35 cm (het papier mag alleen met rubber handschoenen aan worden vastgepakt!) en breng de verschillende aminozuuroplossingen met pH = 6,5 met een pipetje in het midden van het elektroforesepapier naast elkaar aan. Stip één keer aan, zodat een vlekje van ongeveer 3 mm diameter ontstaat, zie tekening hieronder.
A = Lysine
B = glutaminezuur
C = alanine
D = mengsel van alanine, glutaminezuur en lysine
Droog de vlekken met de föhn; bevochtig het papier met de oplossing met pH = 6,5 door de uiteinden in de
oplossing te drenken. De opbrengpunten mogen niet in de oplossing komen.
Leg het papier op de glasplaat van het elektroforesebakje. De uiteinden van het papier moeten in de oplossing hangen. Plaats de beschermkap over het elekroforeseapparaat en sluit de gelijkspanningsbron van 300 V (4- 8 mA) aan.
Laat de elektroforese 30 minuten duren (opmerking 1).
Droog het papier dan met de föhn; haal het vervolgens door de ninhydrine-oplossing en droog nogmaals. Gebruik hierbij rubber handschoenen.
Herhaal het experiment met de oplossing met pH = 1,6. De elektroforesetijd is hierbij 45 minuten.
Opmerking 1.
Een geringe verplaatsing van alanine bij pH = 6,5 is een gevolg van elektro-osmose. Het water wordt ten opzichte van het papier enigszins positief geladen en beweegt naar de - pool waarbij het de opgeloste
stof meeneemt.
Bepaling van het iso-elektrisch punt (IEP) van aminozuren
Het iso-elektrisch punt (IEP) van aminozuren is de pH-waarde van de oplossing waarin het aminozuur geen verplaatsing geeft bij elektroforese.
Benodigdheden
elektroforese-apparatuur
gelijkspanning 300 V
föhn
Whatman 1 - chromatografiepapier
twee roerstaafjes
pipetjes met nauwe opening
rubberhandschoenen
bekerglas 1000 mL
bekerglas 250 mL
3 bekerglazen 100 mL
4 maatcilinders 5 mL
2 maatcilinders 25 mL
2 maatcilinders 50 mL
maatcilinder 250 mL
maatcilinder 1000 mL
pH-meter
pH-elektrode
8 reageerbuizen
Chemicaliën
alanine
glutaminezuur
lysine
ninhydrine
aceton
bufferoplossing pH = 4,0
bufferoplossing pH = 5,0
bufferoplossing pH = 6,0
bufferoplossing pH = 7,0
bufferoplossing pH = 8,0
bufferoplossing pH = 9,0
0,5 M zwavelzuuroplossing
0,1 M natronloog
Voorbereidende werkzaamheden
- IJk de pH-elektrode voor het pH-gebied 0 - 7
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=4,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 4,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 0 - 7.
- Maak een oplossing met pH = 4
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg 2 druppels 0,5 M zwavelzuuroplossing toe en homogeniseer.
De pH van deze oplossing zal nu 4 zijn. Controleer de pH van de oplossing met een pH-meter.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 5
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 30 mL van de oplossing met pH = 4.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en verdun deze oplossing met gedestilleerd water tot pH = 5.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 6
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 30 mL van de oplossing met pH = 5.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en verdun deze oplossing met gedestilleerd water tot pH = 6.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- IJk de pH-elektrode voor het pH-gebied 7- 14
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met pH=9,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 9,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 7 - 14 .
- Maak een oplossing met pH = 7
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en voeg druppelsgewijs 0,1 M natronloog toe tot dat de pH = 7.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 8
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en voeg druppelsgewijs 0,1 M natronloog toe tot dat de pH = 8.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 4
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 4 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 4 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 5
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 5 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 5 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 6
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 6 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 6 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 7
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 7 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 7 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 8
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 8 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 8 in een reageerbuis.
- Maak een ninhydrine oplossing
Neem een bekerglas van 100 mL en los 0,1 g ninhydrine op in 50 mL aceton. Homogeniseer.
Uitvoering
Voer met de oplossingen van de aminozuren elektroforeses uit bij de verschillende pH waarden.
De elektroforesetijd is 30 - 40 minuten.
Bepaal het IEP van lysine en alanine.
De elektroforese-apparatuur bestaat uit twee perspexbakjes (14 cm x 6 cm x 6 cm), bevestigd op een grondplaat elk voorzien van een 20 cm lange platina- draad (als elektrode) met aansluitklemmen. Als lijmmiddel kan chloroform gebruikt worden. Over de bakjes wordt een glasplaat (22 cm x 12 cm) gelegd. Bij gebruik moet als afscherming een plastic bak over het geheel worden geplaatst, zie tekening hierboven.
Vul de elektroforesebakjes voor ongeveer de helft met de oplossing met pH = 4.
Knip stroken elektroforesepapier van 10 cm x 35 cm (het papier mag alleen met rubber handschoenen aan worden vastgepakt!) en breng de verschillende aminozuuroplossing met pH = 4 met een pipetje in het midden aan. Stip één keer aan, zodat een vlekje van ongeveer 3 mm diameter ontstaat.
Droog de vlekken met de föhn; bevochtig het papier met de oplossing met pH = 4 door de uiteinden in de
oplossing te drenken. De opbrengpunten mogen niet in de oplossing komen.
Leg het papier op de glasplaat van het elektroforesebakje. De uiteinden van het papier moeten in de oplossing hangen. Plaats de beschermkap over het elekroforeseapparaat en sluit de gelijkspanningsbron van 300 V (4- 8 mA) aan.
Laat de elektroforese 30 - 45 minuten duren.
Droog het papier dan met de föhn; haal het vervolgens door de ninhydrine-oplossing en droog nogmaals. Gebruik hierbij rubber handschoenen.
Herhaal het experiment met de oplossing met pH = 5,6,7 en 8.
Bepaal het IEP van de gebruikte aminozuren.?
Literatuur
1. B. L. Williams, K. Wilson, Principles and techniques of practical chemistry, p. 106 (1975).
2. Instructions Griffin, electrophoresis apparatus S24-800 IS 1731/7508.
3. P. J. de Rijke en W. v.d. Veer, Research Instituut Schoolscheikunde, Vakdidactiek Scheikunde, Rijksuniversiteit Groningen, m.m.v.: W. Hoeve, J. Sinke. RIS-publicatie XXIV
