Voorschriften Methode-ontwikkeling en validatie

Voorschrift 01: Carbamazepine in serum met de HPLC

Inleiding

Carbamazepine is een anti-epilepticum, het beperkt snel een overprikkelde hersenlading, hierdoor word je in feite wat rustiger. Vanuit de hersenen worden continu elektrische ladingen doorgegeven aan het lichaam, door deze elektrische ladingen kan er beweging plaatsvinden. Carbamazepine kan helpen bij epilepsie, zenuwpijn, bipolaire stoornis manie, diabetes insipidus maar ook bij ontwenningsverschijnselen van een verslaving. Carbamazepine heeft een lage chronische toxiciteit, hierdoor kan het goed worden toegepast zonder ernstig letsel op de lange duur. Hierdoor is het voor de patiënt veilig te gebruiken, zonder dat er zorgen hoeven ze zijn over schade achteraf.

 

Referentiewaarden:

Therapeutisch:  4 - 12 µg/ml

Toxisch:  > 15 µg/ml

Reagentia en apparatuur

Reagentia

- Stock-standaard carbamazepine (1 mg/ml in methanol)

- Eluens: 18 Acetonitril: 19 methanol: 63 milliQ (v/v/v)

 

Apparatuur

- High performance liquid chromatography met UV-detector

- Centrifuge

Werkwijze

Voor de standaardreeks wordt de verdunde stock-oplossing gebruikt. Als de stock-standaard op is, moet deze opnieuw worden gemaakt.

- Stock-standaard carbamazepine 1 mg/ml, weeg 100 mg carbamazepine in een maatkolf van 100 ml en vul aan met methanol.

 

Maak vanuit de stock-standaard een verdunning.

- Stock-verdunning carbamazepine 10 μg/ml, pipeteer 100 μl van de stock carbamazepine in een maatkolf van 10 ml. Vul de maatkolf aan met methanol.

 

Werkwijze:

Alles wordt direct in vails gepipeteerd.

Pipeteer volgens onderstaand schema

Naam

Pipeteren Vst (µl)

Pipeteren CM (µl)

Pipeteren M (µl)

Concentratie (µg/ml)

C1

225

 

 

1,5

C2

450

 

 

3

C3

675

 

 

4,5

C4

900

 

 

6

C5

1125

 

 

7,5

C6

1350

 

 

9

CM

 

500

 

?
CM

 

 500   ?

M1

 

 

500

?

M2

 

 

500

?

 

  1. Vul alle vails tot 1,5 ml met methanol.
  2. Meng alle vials minimaal 30 sec op de vortex.
  3. Als de oplossingen troebel zijn --> ga naar stap 4. Als de oplossingen helder zijn --> ga naar stap 5.
  4. Doe alle vails in de centrifuge en laat deze op 4200 rpm 10 min draaien.
  5. Zet alle vails in de HPLC.

 

De volgende stappen zijn allemaal op de HPLC. Als iets niet te vinden is, bekijk de instructievideo van dhr. Dousma.

- Open het mapje ‘20200708 MN test 3’ op de HPLC (deze is te vinden op HPLC 1, leerjaar 3).

- Zorg dat alle instellingen gecontroleerd zijn (instellingen staan onderaan de pagina).

- Purge de HPLC met het juiste eluens.

- Laat de kolom 10 min doorspoelen met het eluens (er moet constante druk zijn).

- Zet de run op de HPLC aan.

 

Instellingen:

- Run time: 15 min

- Flow-rate: 1,0 ml/min

- Eluens: 18 acetonitrol: 19 methanol: 63 milliQ (v/v/v)

- Kolom: μ-Bondapak C18 (150 mm x 4,6 mm i.d.)

- UV-detector: 284 nm

- Injectie volume: 50 μl

- Minimale pomp druk: 10 bar

- Maximale pomp druk: 200 bar

- Needle stroke: 31 mm (docent vragen of dit klopt aan de hand van de vails)

 

Uitwerking

Maak een meetrapport en met daarin een ijklijn en de gevonden concentraties.

Bereken de concentraties van het controle monster en het monster aan de hand van de ijklijn.

Let daarbij goed op de eenheden van de concentraties.

Afval

De vials gaan allemaal in afvalvat 3.

Voorschrift 02: De bepaling van acetaat in de conserveringsvloeistoffen van zilveruitjes en augurken m.b.v. ion chromatografie.

Inleiding

In deze bepaling wordt de concentratie van het acetaat-ion gemeten op de ion chromatograaf. Het acetaat-ion is een anion (negatief ion). Dit anion komt voor in de conserverings-vloeistof van augurken en zilveruitjes. Met behulp van ion chromatografie kunnen ionen worden gescheiden op basis van hun ionaire eigenschappen.

Reagentia en apparatuur

Apparatuur:

  • Ion chromatograaf (Henry) met de volgende onderdelen: Dionex ionpac AS19-4μmm RFIC analytical (kolom), suppressor, CR_TC en eluens generator. Eluens is KOH (kaliumhydroxide).

Reagentia:

  • Stof CAS-nummer.
    Natriumacetaat 127-09-3
       

Werkwijze

 

Opstarten ion chromatograaf.

Als de ion chromatograaf al aan is sla dan dit gedeelte over.

  • Kijk of de ion chromatograaf aan is. Dit kun je zien doordat het display licht geeft als je op menu drukt.
  • Start chromeleon op op de pc, klik op henry. Kijk hierna of de software verbonden is met de ion chromatograaf zelf, kijk hiervoor of de groene bolletjes (zie afbeelding) licht geven. Zo niet klik hierop.

​

  • Wanneer de chromatograaf uit is, moet het systeem eerst worden gepurged/geprimed. Dit staat in de software en op de ion chromatograaf als prime. Draai hiervoor de prime schroef open (zie afbeelding). Klik daarna op prime. Het primen zal ongeveer na 5 minuten uit zichzelf stoppen. Draai nadat hij gestopt is de purge kraan weer dicht.
  • Zet de pomp aan. Wacht tot deze druk stabiel is. Hierna kan de suppressor, eluens generator en de CR_TC worden aangezet.

 

Standaardreeks maken.

  • Weeg ongeveer 140 milligram natriumacetaat af. Breng dit hierna over in 100 mL maatkolf. Vul alles aan met milliQ ABSOLUUT GEEN DEMIWATER.
  • Pipetteer hieruit 10 mL in een 100 mL maatkolf en vul aan.
  • Pipitteer hieruit 6, 7, 8, 9, en 10 mL in 10 ml maatkolven en vul aan.
  • Pak het benodigde aantal vials zonder schroefdop, verwijder de septum uit de dop en bevestig de dop op de vial met behulp van de tang.
  • Zet alle vials in de ion chromatograaf en noteer welke vial waar staat.

 

Monstervoorbereiding en controlemonster maken.

  • Filtreer conserveringsvloeistof vanuit de pot augurken en zilveruitjes in een bekerglas.
  • Verdun hierna het monster 100 keer. Vul alles aan met milliQ ABSOLUUT GEEN DEMIWATER.
  • Weeg voor het controlemonster ongeveer 1000 milligram natriumacetaat af en los dit op in een 100 mL maatkolf.
  • Verdun het controlemonster 10 keer.
  • Pak het benodigde aantal vials zonder schroefdop, verwijder de septum uit de dop en bevestig de dop op de vial met behulp van de tang.
  • Zet alle vials in de ion chromatograaf en noteer welke vial waar staat.

 

Sequence maken en starten van de meting.

  • Ga in de software naar henry en kopier de sequence "acetaat meting kopieren methode" nadat je deze sequence hebt gekopieerd vervang de naam op de volgende manier: datum-eerste letters naam-acetaat aug en zil. voorbeeld: 22032020-MD-acetaat aug en zil.
  • Noteer in de software de namen van de vials op de manier waarop jij weet wat wat is. geef aan welke vial waar staat.
  • Controleer of alles aan staat en of je jou sequence goed hebt ingevuld m.b.t. de plekken van de vials.
  • Controleer ook of er nog genoeg MilliQ in de vaten van de ion chromatograaf zelf zit. Laat de kolom niet droog lopen.
  • Start hierna de sequence. Kijk hoe de eerste meting verloopt. De retentietijd van acetaat zit rond de 4,3-4,4 min.

Uitwerking

Verwerk de resultaten in een meetrapport. De ijklijn, waarden van de monsters, standaarden en controlemonsters weergeven in mg/L. chromatogrammen en piekoppervlakten in het meetrapport verwerken. LET OP, er wordt natriumacetaat ingewogen maar de acetaat concentratie wordt gemeten, neem dit mee met de berekeningen.

Afval

Deponeer alle oplossingen in afval 0.  De vials mogen na de meting in de glasbak.

Voorschrift 05: Bepaling van chloride in conserveringsvloeistof van augurken en zilveruitjes m.b.v van de IC

Inleiding

In deze bepaling wordt het anion chloride uit conserveringsvloeistof van augurken en zilveruitjes gemeten met behulp van de ionchromatograaf.

Bij ionenwisselingschromatografie worden geladen deeltjes door onderlinge aantrekking of afstoting gescheiden. Het is een scheiding door middel van ladingsverschillen. De stationaire fase is een dragermateriaal met ionen. Voor basische stoffen word er een anionwisselaar gebruikt, hierdoor worden de negatieve ionen verwisseld. Hierbij geldt dat hoe hoger de ionlading is des te hoger de affiniteit is.

Reagentia en Apparatuur

Reagentia

Standaarden & controle monster

Naam van de stof

CAS-nummer

Natriumchloride

7647-14-5

 

Monster
Augurken
Zilveruitjes

Apparatuur
Ionchromatograaf
- Eluens: KOH
- Eluens generator
- Suppressor
- Flow: 0,3 ml/min
- Kolom: Dionex Ionpac AS 19-4 μm IC
- Detector: geleidingsvermogen detector 

Werkwijze

Let op: Al het water dat gebruikt wordt is milliQ water!  

Standaarden
1. Weeg 263,7 mg natriumchloride (± 10,0) in en los deze op in een maatkolf van 100 ml en vul deze aan.
2. Pipetteer 10 ml van de oplossing in een maatkolf van 100 ml en vul deze aan.
3. Pipetteer volgens het volgende schema:

 

Pipet (ml)

Maatkolf (ml)

C1

1

10

C2

2

10

C3

3

10

C4

4

10

C5

5

10


Controlemonster

1. Weeg 453,3 mg natriumchloride (± 10,0) in en los deze op in een maatkolf van 100 ml en vul deze aan.
2. Pipeteer 10 ml hiervan in een 100 ml maatkolf en vul deze aan.
3. Pipeteer 1 ml van het controlemonster in een maatkolf van 10 ml en vul deze aan.

Monster augurk en zilveruitjes
1. Giet het vloeistof in de pot af in een trechter met een filterpapier en vang dit op in een bekerglas van 300 ml.
2. Pipeteer 1 ml van het monster in een maatkolf van 250 ml en vul deze aan.
3. Doe dit voor zowel augurk als zilveruitjes.

Meting op de ionchromatograaf
Gebruik GEEN schroefdop vials!
1. Haal de septum uit de doppen voor de vials.
2. Breng de oplossingen over in vials en zet deze in de ionchromatograaf (vergeet niet de plek te noteren).
3. Kopieer de methode ''Chloride meting methode'' en geef deze een andere naam. Zet hier wel je naam en de datum wanneer de meting is gestart bij.
4. Controleer of de posities overeen komen met de posities van de vails.
5. Start de meting.

De pieken van chloride bevinden zich rond de 6,000 min

Uitwerking

Vermeld in de uitwerking de volgende punten:

  • De inweeg van de standaarden
  • De (controle)monster gegevens 
  • De area’s
  • Grafiek(en) met de ijklijn en R2
  • De berekende concentraties voor chloride in g/l.
  • Conclusie
  • Discussie
  • De chromatogrammen

Verwerk de resultaten van dit practicum in een meetrapport. Lever deze op de afgesproken wijze in.

Afval

De gebruikte reagentia en monsters kunnen door afvalvat 0.

De gebruikte vials met vloeistof kunnen in het afvalvat voor vials.

Voorschrift 07: gehalte anionen in conserveermiddel van zilveruitjes en augurken m.b.v. ionchromatografie

Inleiding

In dit experiment wordt er gekeken naar  vier anionen in het conserveermiddel uit een pot augurken en een pot zilveruitjes. De vier anionen zijn: acetaat, chloride, nitraat en sulfaat. Een conserveermiddel is een stof die wordt toegevoegd aan levensmiddelen, cosmetica en andere bederfelijke producten om de houdbaarheid ervan te verlengen. Het  is er dus voor om de groei van bacteriën, schimmels en gisten tegen te gaan.

 

Reagentia

Stockoplossing

Stof

CAS-nummer

Concentratie in miliQ

Natriumacetaat

127-09-3

100 ppm acetaat

Natriumchloride

7647-14-5

100 ppm chloride

Natriumnitraat

7631-99-4

100 ppm nitraat

Natriumsulfaat decahydraat  

7727-73-3

100 ppm sulfaat

 

Monster

  • Conserveermiddel augurken 1000x verdund in miliQ.

  • Conserveermiddel zilveruitjes 1000x verdund in miliQ.

 

Apparatuur

Ion chromatograaf thermosientific

Kolom: DionexTMIonPacTMAS19-4um IC Colom  

Parameters:  

  • Flow: 0,3000 ml/min.  

  • Injectie volume: 25 µL.  

  • Het oplopend gradiënt beginnend op 10mM en loopt van de tiende minuut tot de vijftiende minuut op naar 45mM, van de achtentwintigste minuut tot de achtentwintigste komma één minuut loopt weer af van 45 naar 10 mM, daarna loopt de cyclus nog door op 10mM tot aan de achtendertigste minuut. Hier stopt de cyclus.  

Werkwijze

LET OP! Gebruik miliQ en geen demiwater!!!

Standaarden

  • Verdun de stockoplossingen door: 1, 2, 3, 4 en 5ml te pipetteren in een 100ml maatkolven.

  • Homogeniseer de maatkolven.

  • Vul de vials.

  • Let op! Gebruik niet de schroefdoppen, maar de caps en haal de septum voordat je de cap op de vial doet eruit. Dit doe je door met een druppelpipet het septum eruit te drukken. De caps doe je op de vial en zet je met een tang vast.

Monster

  • Filter het conserveermiddel van de augurken en de zilveruitjes doormiddel van filterpapier, een trechter en een 100ml duran flesje. Nu heb zijn er dus 2 flesjes. 1 met het conserveermiddel van de augurken en 1 met het conserveermiddel van de zilveruitjes.

  • Verdun de monsters 1000x door 0,01ml in een maatkolf van 10ml te pipetteren en deze aan te vullen met miliQ.

  • Homogeniseer de maatkolven.  

  • Vul de vials.  

  • Let op! Gebruik niet de schroefdoppen, maar de caps en haal de septum voordat je de cap op de vial doet eruit. Dit doe je door met een druppelpipet het septum eruit te drukken. De caps doe je op de vial en zet je met een tang vast.

 

Inzetten

  • Zet de vials in het rekje van de ion chromatograaf. Kijk goed op welke plek je de vials neerzet.

Als de ion chromatograaf nog uit staat zijn er een paar dingen die je moet doen voordat je kunt meten.

  • zet de ion chromatograaf en de computer aan.

  • start de software van chromeleon op.

  • selecteer Henry (zo heet de ion chromatograaf).

  • Controleer of de computer een connectie heeft met de ion chromatograaf.  

  • Open de bovenste, rechter klep van de ion chromatograaf en draai de knop iets open.

  • Druk op flush. Dit staat onder het kopje “pump”.

  • Controleer of er nog genoeg miliQ is. als dit niet het geval is vul dit aan. Er moet nu geprimed worden. Dit doe je door op prime te drukken (in de lange cilinder boven op de ion chromatograaf zit het miliQ).

  • Vergeet niet de knop weer dicht te draaien!!

  • Nu kun je alles aan zetten onder het kopje “pump”.

Analyse starten

  • Om de analyse te starten is er een methode nodig. Deze is al aangemaakt in het mapje “20200227mvlrmd“.  

  • Om te meten kopieer dit mapje en geef dit een andere naam zodat jezelf de resultaten weer kunt terugvinden.

  • Nu kan de plek van de vials worden ingevuld.

  • Nu kan de analyse worden gestart door op Run te drukken.

Berekening

Verwerk de gegevens op de juiste wijze

Uitwerking

Voor de uitwerking van dit experiment schrijf je een meetrapport.

  • Een ijklijn waarin de oppervlakte van de piek is uitgezet als functie van de concentratie.

  • Een berekening om de concentraties te berekenen van: Let op in welke eenheid de concentratie berekend moet worden.

Acetaat mg/l

Chloride g/l

Nitraat mg/l

Sulfaat g/

Afval

  • De gebruikte reagentia en monsters kunnen door afvalvat 0.

  • De gebruikte vials kunnen in het afvalvat voor vials.  

Voorschrift 08: Vertenex in wasverzachter bepalen d.m.v. Headspace

Inleiding

Vertenex is een veel gebruikte geurcomponent in wasverzachter. vertenex bestaat uit een cis- en trans isomeer. De verhouding tussen beide is ongeveer 35/65. Vooral de cis-isomeer zorgt voor de geur. De twee isomeren vormen de ingredient vertenex.

De vloeibare wasverzachters zijn emulsies in water of water/alcoholmengsels. De concentratie van de kationische oppervlakte-actieve stof in een vloeibare wasverzachter is laag (5 à 10%).

Vertenex wordt in deze methode bepaald d.m.v. de interne standaard m.b.v. headspace. De interne standaard die gerbuikt wordt is dihydromyrcenol. Deze stof wordt gebruikt, omdat het ook een isomeer is. Headspace zorgt ervoor dat het monster verdampt. De damp komt boven de vloesitof terecht en wordt geinjecteerd. Het wordt geinjecteerd d.m.v. splitless injectie. 

 

 

Reagentia en apparatuur

Reagentia

Naam reagentia

CAS-nummer

Vertenex  (veiligheidskaart)

32210-23-4

dihydromyrcenol (veiligheidskaart)

18479-58-8

Neutral wasverzachter

-

Controlemonster (Robijn)

-

         

Apperatuur

  • Gaschromatograaf (Zhahrah)

Werkwijze

  • Pipeteer volgens onderstaande schema direct in een vial (20cc):

Nummer  

Vertenex (µl)

dihydromyrcenol (µl)

Neutral (g)

C0  

0

30

1

C1

5

30

1

C2

10

30

1

C3

20

30

1

C4

40

30

1

C5

80

30

1
  • ​Doe het dopje op de vial en maak deze dicht.

Monster

  • Weeg 1 gram van het monster af in een vail (20cc).
  • Pipeteer 5 µl dihydromyrcenol in hetzelfde vail.
  • Doe het dopje op de vial en maak deze dicht.

Controlemonster

  • Weeg 1 gram Robijn wasverzcahter af in een vail (20cc).
  • Pipeteer 5 µl dihydromyrcenol in hetzelfde vail.
  • Doe het dopje op de vaill en maak deze dicht.

Voorbereiding op de gaschromatograaf

  • Draai de drie kranen open.
  • Zet nu de gc aan door op het knopje links onderin te drukken en het kastje ernaast aan te zetten.
  • Start nu het software programma Clarity op.
  • Open het mapje KILO wasverzachter.
  • Open nu het mapje dihydromyrcenol Xander
  • Zoek naar de methode van wasverzachter.
  • Kopieer de sequence en sla dit op met je eigen initalen.

Uitwerking

Maak een meetrapport met daarin:

  • Doel van de proef
  • Principe van de poref
  • Alle resultaten/meetwaarden
  • IJklijn
  • Berekening
  • Conclusie
  • Discussie

Afval

  • Alle overgebleven vloeistoffen moeten in afvalvat 3.
  • Vials moeten in het afvalvat voor de vials. 

Voorschrift 09: Vertenex bepalen in wasverzachter d.m.v headspace

Inleiding

Een wasverzachter is een middel dat in het wasproces met het laatste spoelwater aan het wasgoed wordt toegevoegd om dit soepeler te laten aanvoelen en om het lekker te laten ruiken. Het product is te verkrijgen in alle mogelijke variaties van geuren, kleuren en concentraties. De vloeibare wasverzachters zijn emulsies in water of water/alcoholmengsels. De concentratie van de kationische oppervlakte-actieve stof in een vloeibare wasverzachter is laag (5 à 10%), behalve in de ultra-geconcentreerde wasverzachters.

Vertenex zit in wasverzachter. Dit is een geurstof.

Vertenex bestaat uit een cis- en een trans-isomeer. De verhouding tussen beiden is ongeveer 35/65. Vooral de cis-isomeer is verantwoordelijk voor de geur. De 2 isomeren vormen de ingredient vertenex. Dit wordt ook wel stereo-isomeren genoemd.

Vertenex wordt bepaald d.m.v. de interne standaard m.b.v. headspace. Headspace zorgt ervoor dat het gemeten monster in een gasfase terecht komt. De damp komt boven de vloeistof terecht. Deze damp wordt geinjecteerd. Ook wordt er gebruikt gemaakt van split-less injectie.
De interne standaard die gebruikt wordt is verdox.

Reagentia en apparatuur

Reagentia

Reagentia

IUPAC Naam

CAS-Nummer

Vertenex

32210-23-4

Verdox

88-41-5

Neutral wasverzachter

-

Controlemonster Robijn

-


Apparatuur

  • Gaschromatograaf (Zhahrah)

​

Werkwijze


Interne standaardmethode  

  • Pipetteer volgens onderstaande schema
  • Doe dit direct in een vial (Zie onderstaande foto)
  • Maak de vial dicht met een magneetdopje.

Nummer  

Vertenex (µl)

Verdox (µl)

Neutral (g)

C0  

0

25

1

C1

5

25

1

C2

10

25

1

C3

20

25

1

C4

40

25

1

C5

80

25

1

 

Monster

  • Weeg 1 gram kilomonster af en doe het direct in een vial (Zie onderstaande foto).
  • Pipetteer 5 µl interne standaard af.
  • Doe de vial dicht met een magneetdopje.

​Controlemonster

  • Weeg 1 gram robijn wasverzachter af en doe het direct in een vial.
  • Pipetteer 5 µl interne standaard af.
  • Doe de vial dicht met een magneetdopje.

Voorbereiding op de gaschromatografie

  • Draai de 3 kranen open. (zie onderstaande foto)
  • Zet de GC aan. Links onderin is de aanknop
  • Links van de GC staat nog een kastje. Achter het kastje is de aanknop.
  • Start nu het softwareprogramma Clarity.
  • Open het mapje Kilo wasverzachter.
  • Open het mapje wasverzachter Tom.
  • Kopieer het mapje en sla het mapje op onder jou initialen.
  • Zoek naar de methode van wasverzachter Tom.
  • Kopieer de sequence. En sla dit op.
  • Druk nu op run sequence.

Uitwerking

Maak een meetrapport:

  • Doel van de proef
  • Principe van de proef
  • IJklijn
  • Conclusie
  • Discussie


Piek ratio= Oppervlakte vertenex/oppervlakte verdox
Concentratie =(y-b)/a
y= piek ratio

Afval

  • Vials moeten in de afvatvails. 
  • Verdox afvalvat 3.
  • Vertenex afvalvat 3.
  • Neutral mag in gootsteen
  • Robijn mag in gootsteen

Voorschrift 10: carbamazepine in serum met behulp van HPLC

Inleiding

In dit voorschrift wordt de werkwijze weergegeven om carbamazepine in serum te meten met behulp van de HPLC.

Carbamazepine is een anti-epilepticum welke gemeten kan worden in het serum van een patiënt.

Carbamazepine wordt gebruikt als medicijn bij bijvoorbeeld epilepsie en persoonlijkheidsstoornissen.

De referentie waarden van carbamazepine zijn als volgt:

- Therapeutische waarde: 4 - 12 mg/l
- Toxisch: > 12mg/l

 

Reagentia en apparatuur

 

Reagentia
IUPAC naam       CAS-nummer
Acetonitril HPLC grade     75-05-8
Methanol HPLC grade     67-56-1
MilliQ        
Carbamazepine       298-46-4

 

Apparatuur

HPLC Nutricia

  • Reverse phase C-18 kolom
  • Eluens: Acetonitril; Methanol; MilliQ (18;19;63 % (v/v/v)
  • Mobiele fase 1,2 ml/min
  • UV detector (210 nm)
  • kolom oven 40 graden Celsius
  • injectie volume:
    • standaard 10 microliter
    • monster 10 microliter
    • controlemonster 10 microliter
  • Runtime 10 minuten

 

Werkwijze

Methode:

!! ALLE MAATKOLVEN EN VIALS WORDEN AANGEVULD WORDEN AANGEVULD MET ELUENS !!

Standaard reeks

  • Maak een master stock van 1 g/l door 100 mg carbamazepine op te lossen in een maatkolf van 100 ml
  • Verdun de master stock tot een concentratie van 0,10 mg/l door 1 ml te pipetteren en aan te vullen tot 10 ml in een maatkolf
  • maak vanuit de verdunde stock een standaard reeks met concentraties van 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 en 20,0 mg/l in crimpcap vials
    pipetteer schema
    Standaard nummer Concentratie (mg/l) Hoeveelheid te pipetteren (microliter)
    C1 1,0 15,0
    C2 2,0 30,0
    C3 5,0 75,0
    C4 10,0 150,0
    C5 20,0 300,0

    • vul alle vials aan met eluens tot deze een totaal volume van 1,5 ml hebben.

Monster

  • ontdooi en homogeniseer het serummonster.
  • Pipetteer 300 microliter in een crimpcap vial, vul dit aan met eluens tot een totaal volume van 1,5 ml
  • vortex het monster voor 10 seconden en centrifugeer het monster vervolgens 10 minuten op de hoogst mogelijke stand.
  • Het monster is nu klaar om te meten.

Uitwerking

Noteer overzichtelijk in een excelsheet,

bij de standaard reeks:

  • C-nummer
  • Concentratie
  • Retentietijd
  • Piekoppervlak
  • Snijpunt
  • Richtingscoëfficiënt
  • Correlatie coëfficiënt

bij het monster:

  • Monsternummer
  • Retentie tijd
  • Piekoppervlak
  • Injectievolume
  • Totaalvolume vial
  • vF
  • Eindconcentratie in mg/l
  • Duploverschil

Bij het controlemonster

  • Controlemonster nummer
  • Retentietijd
  • Piekoppervlak
  • Injectievolume
  • Totaalvolume vial
  • vF
  • Eindconcentratie in mg/l
  • Duploverschil

Afval

De vials mogen na de meting in afvalvat 3.

Voorschrift 03: Metalen in premix veevoeder d.m.v. AAS

Inleiding

In deze bepaling worden de concentraties van de metalen ijzer en magnesium in premix veevoeder bepaald. Dit wordt gedaan door middel van atomaire absorptiespectrometrie.

 

Referentiewaarden:

0 – 40 mg/g voor beide metalen.

Reagentia en apparatuur

Reagentia

naam % CAS-nummer
Zoutzuur 36% 7647-01-0
Salpeterzuur 65% 7697-37-2
Mohrs zout   10045-89-3
Magnesiumchloride hexahydraat   7786-30-3

 

Monstermateriaal

  • Premix veevoeder

 

Controlemonster

  • Magnesiumstandaard 1000 ppm voor AAS
  • IJzerstandaard 1000 ppm voor AAS

 

Apparatuur

  • Perkin Elmer Atomaire Absorptie Spectrometer AAnalyst100
  • Magneetroerders

Werkwijze

Vul alle maatkolven aan met milliQ water!!!

 

Monstervoorbewerking

  1. Doe een kleine hoeveelheid premix in een vijzel en maal het tot het een egaal fijn poeder is.
  2. Weeg 100 mg gemalen premix af in een maatbeker van 150 ml.
  3. Zet het bekerglas in de zuurkast en voeg met een maatcylinder 10 ml salpeterzuur en 30 ml zoutzuur toe.
  4. Los de premix voor 15 minuten op m.b.v. een magneetroerder en laat de gele dampen volledig verdampen.
  5. Breng de monsteroplossing over in een maatkolf van 100 ml met behulp van een trechter en filterpapier van 180 μm. Vergeet het filterpapier niet van te voren vochtig te maken en spoel het bekerglas en filterpapier 3 keer na met MilliQ water.

 

Standaarden

  1. Weeg ca. 2097 mg magnesiumchloridehexahydraat in en breng dit over in een maatkolf van 250 ml.
  2. Hieruit wordt een magnesiumstock gemaakt door 1 ml in een maatkolf van 10 ml te pipetteren.
  3. Weeg ca. 1757 mg Mohrs zout in en breng dit over in een maatkolf van 250 ml.
  4. Hieruit wordt een ijzerstock gemaakt door 1 ml in een maatkolf van 10 ml te pipetteren.
  5. Neem 6 maatkolven van 100 ml.
  6. Pipetteer volgens het volgende schema:
  C0 C1 C2 C3 C4 C5

IJzerstock

0 ml

2 ml

4 ml

6 ml

8 ml

10 ml

Magnesiumstock

0 ml

1 ml

2 ml

3 ml

4 ml

5 ml

 

Monster

Voer de volgende stappen in duplo uit!!!

 

  1. Pak 2 maatkolven van 10 ml, een voor ijzer en een voor magnesium.
  2. Pipetteer 1 ml monster in een 10 ml kolf voor ijzer.
  3. Pipetteer 0,5 ml monster in een 10 ml kolf voor magnesium.

 

Controlemonster

  1. Pipetteer 0,3 ml magnesium AAS standaard in een maatkolf van 10 ml.
  2. Pipetteer 0,2 ml ijzer AAS standaard in dezelfde 10 ml maatkolf, dit is het controlemonster.

 

Voer de volgende stappen in duplo uit!!!

 

  1. Pak 2 maatkolven van 10 ml, een voor ijzer en een voor magnesium.
  2. Pipetteer 1 ml monster in een 10 ml kolf voor ijzer.
  3. Pipetteer 0,5 ml monster in een 10 ml kolf voor magnesium.

 

Gebruik AAS

Noteer naast de resultaten de standaarddeviatie die de AAS aangeeft!!!

 

  1. Voordat de AAS aanstaat, zorg ervoor dat de afzuiging aanstaat (draai de knop naast de groene knop) en de gastoevoer open staat (gele draaiventiel naar links draaien). kijk van te voren of de manometers van gas en perslucht aangeven dat er druk is.
  2. Zet de AAS en daarna de PC aan. Als de PC vastloopt kan deze met de aan/uit knop opnieuw opgestart worden.
  3. Dubbelklik op het programma AAnalyst100 en zoek de methode voor het element dat gemeten moet worden op. (File links bovenin → open → method)
  4. Open “results”, “flame” en “manual”.
  5. Zet de vlam aan.
  6. Controleer de aanzuigsnelheid door het slangetje in een buisje met milliQ te houden. Deze zou meer dan 3 ml/min moeten zijn.
  7. Om blanco te stellen klik op “analyse blank”, er verschijnt een venster die uitlegt welke standaard het apparaat eerst wil meten en welke daarna. Volg de instructies van het apparaat. (voor de blanco wordt alleen milliQ gebruikt!)
  8. Voer de metingen één keer uit, het apparaat meet al in duplo. De monsters worden gemeten door op de knop “analyse sample” te klikken.  

Uitwerking

Verwerk de volgende onderdelen in de uitwerking:

  • De inweeg van monsters
  • De extincties
  • De ijklijnen
  • De richting, snijpunt en R2
  • Berekeningen
  • Conclusie in mg/g
  • Discussie

Lever de uitwerking op afgesproken wijze in.

Afval

Alle monster oplossingen gaan in afvalvat 1.

Alle standaardoplossingen gaan in afvalvat 4.

Voorschrift 04: Metalen in premix bepalen met behulp van de AAS/AES

Inleiding

In dit onderzoek worden de verschillende metaal gehaltes in een veevoeder premix bepaald. Er waren tot voorheen nog geen bekende methodes hiervoor binnen ROC van Twente, vandaar dit onderzoek. De volgende metalen zullen worden bepaald;

  • Calcium, Natrium, IJzer, Magnesium, Mangaan, Zink en Koper

Overigens zal er wegens omstandigheden specifiek naar alleen Calcium en Natrium moeten worden gekeken.

Tenslotte zal dit onderzoek uitgevoerd worden met behulp van de Atomaire Absorptie Spectrofotometer en de Atomaire Emissie Spectrofotometer.

Apparatuur en reagentia

Apparatuur:

  • Atomaire Absorptie Spectrometer/Atomaire Emissie Spectrometer (AAS/AES)
  • Geschikte lampen voor de elementen;
    • Eventuele combi lampen zouden ook geschikt zijn indien ze de aanwezige stoffen meten. Indien dit niet het geval is zal er gebruik moeten worden gemaakt van de solo lampen:
      • IJzer-lamp
      • Magnesium-lamp
      • Mangaan-lamp
      • Zink-lamp
      • Koper-lamp

Materialen/reagentia:

Benodigde stoffen Casnummer Concentratie (p.p.m)
Natrium chloride (99,5%) 7647-14-5 1000
Calciumchloride (96%) 10043-52-4 1000
IJzer Standaardoplossing, AAS - 1000
Magnesium in 5% HNO3 7439-95-4 1000
Mangaan standaardoplossing, AAS - 1000
Zinknitraat, AAS 10196-18-6 1001 mg/l ± 2 mg/l
Koper(II)nitraat, AAS 3251-23-8 1001 mg/l ± 2 mg/l
Salpeterzuur (65%) 7697- 37-2 -
MilliQ -
Kookplaat - -

Werkwijze

Monster bereiding: (Werk in duplo)

1. Weeg ± 5,00 gram Premix af in een bekerglas van 250 ml.

2. Voeg in de zuurkasts geleidelijk 15 ml H2SO4 (65%) onder zwenken toe aan het bekerglas, zwenk continue totdat de oplossing stopt met reageren. Voeg ongeveer 40 ml metaalvrij water toe. Plaats vervolgens het bekerglas met horlogeglas op een kookplaat en breng de oplossing lichtelijk aan de kook totdat er geen nitreuze dampen meer vrijkomen.

3. Vervolgens kan de oplossing kwantitatief over worden gebracht naar een 250 ml maatkolf, hiervoor dient de oplossing eerst door een filter heen te gaan. Spoel het filter 2x na met metaalvrij water nadat alle vloeistof is gefiltreerd.

4. Vul het gefiltreerde monster aan tot 250 ml met metaalvrij water en homogeniseer.

5. Breng 1 ml van het gefiltreerde monster over in een maatkolf van 100 ml en vul deze aan metaalvrij water.

Validatiemonster bereiding:

Voor het valideren van deze methode zal er in vijfvoud per metaal een validatiemonster moeten worden opgesteld. Er is voor gekozen om voor Calcium een validatie monster met 30 ppm op te stellen en voor Natrium is gekozen voor een 20 ppm validatie monster. Deze referentiemonster moeten indivuele opgewekte monster zijn, twee keer meten vandezelfde opwerking telt niet.

Maak gebruik van het geleverde validatiesheet om deze methode te kunnen valideren.

 

Standaardreeks:

1. Er zal doormiddel van een pipetman het onderstaande pipetteerschema moeten worden gevolgd:

Let op de correct maatkolf! Calcium Natrium
(50 ml maatkolf) (50 ml maatkolf)
Pipetteerschema Volumes (ml)
C0 0 0
C1 1 0,1
C2 2 0,2
C3 3 0,5
C4 5 1

 

Meten:

Nu kan er gemeten worden doormiddel van de AAS/AES, denk eraan om de standaarddeviatie die gemeten wordt door de AAS in de gaten te houden i.v.m. afwijkingen hoger zijn dan 1,5%.

Uitwerking

  • Verwerk de gevonden extincties in het geleverde validatie sheet en controleer of de methode keuring is gelukt. Indien dit niet het geval is zullen de validatiemonster opnieuw moeten worden gemaakt en gemeten.
  • De concentraties zullen automatisch worden berekend, echter is het nog wel nodig om handmatig de concentraties van de referentiemonster in te voeren in de "Referentiewaardes" map. Vervolgens zullen deze waardes wel automatisch in de Shewhartkaart terecht komen.
  • Tenslotte kunnen de resultaten per mail worden doorgestuurd naar het onderstaande mailadress:
    • 0297125@student.rocvantwente.nl

Afval

De gemaakt oplossingen kunnen worden weggegooid in afval 1.

Voorschrift 11: Metalen in veevoer premix m.b.v. AAS

Inleiding

Het monstermateriaal van deze analyse is een premix van veevoer. Hierin zijn een aantal metalen verwerkt zodat het vee genoeg van deze metalen binnen krijgt. De metalen die in deze analyse bepaald worden zijn koper en ijzer. Het gehalte koper in de veevoer premix ligt tussen 0 en 1000 mg/g. Het gehalte ijzer in de veevoer premix ligt tussen 0 en 40 g/kg. De gehaltes worden bepaald met behulp van AAS.

Reagentia en apparatuur

Reagentia

Naam chemicaliën

Concentratie

CAS-nummer

Stockstandaard

842,63 mg/l mohr's zout

785,89 mg/l kopersulfaatpentahydraat

7783-85-9

7758-99-8

 

Controlemonster

Zie onderzoeksverslag

7783-85-9

7758-99-8

Salpeterzuur

65 %

7697-37-2

 

Apparatuur

  • AAS (Victor)
  • Elektrische kookplaat
  • Lampen/combilampen voor de te bepalen metalen

Werkwijze

Monstervoorbereiding

  • Weeg in duplo 5 gram premix af in een maatbeker van 250 ml.
  • Zet het bekerglas in de zuurkast en voeg hier in kleine porties, onder zwenken, 40 ml salpeterzuur 65% aan toe.
  • Laat de gele nitreuze dampen verdampen door te zwenken en eventueel door wat te verwarmen met een elektrische kookplaat. Damp in tot ongeveer 25 ml.
  • Voeg wat milliQ water toe, de oplossing begint weer gele nitreuze dampen te dampen. Laat alle dampen verdampen door te zwenken en eventueel wat te verwarmen.
  • Laat de oplossing afkoelen.
  • Filtreer de afgekoelde oplossing door een koffiefilter in een maatkolf van 250 ml. Spoel het filter drie keer na met milliQ water.
  • Vul de maatkolven aan tot 250 ml.

 

Ijklijn

  • Pipetteer van de stockstandaard 0; 1; 2; 3; 4 en 5 ml in maatkolven van 100 ml, vul aan met milliQ water.

 

Monster en controlemonster

  • Pipetteer het monster in duplo door 2 ml te pipetteren in een maatkolf van 100 ml, vul aan met milliQ water.
  • Pipetteer het contolemonster in duplo door 2 ml te pipetteren in een maatkolf van 100 ml, vul aan met milliQ water.

 

Meten

  • Zet de AAS aan met de knop op de rechter zijde.
  • Vervang eventueel een lamp met de benodigde lampen.
  • Selecteer de methode “Fe KILO” voor het meten van ijzer en “Cu KILO” voor het meten van koper.
  • Zet de vlam aan.
  • Controleer of de aanzuigsnelheid van het monster juist is. Deze moet minimaal 3 ml/min zijn.
  • Meet de standaarden, monsters en controlemonsters met beide methoden. Noteer hierbij de extinctie en standaard deviatie.

Uitwerking

  • Zet de meetwaarden van de standaarden uit in ijklijnen.
  • Bereken de gehaltes van de metalen in het monster en controlemonster met de vergelijking van de ijklijnen.

Afval

  • Alle oplossingen gaan in afvalvat 1.

Voorschrift 6000: probeer

inleiding