Om van een bevruchte eicel een embryo te vormen is er zowel een toename van cellen nodig door proliferatie (celdeling) als ook een toename van celtypen door differentiatie. Daarnaast dient er polariteit ofwel verschillende uiteinden, gegenereerd te worden om de toekomstige lichaamsassen te bepalen. Waar is het hoofd, waar de staart? Waar is de rug en waar is de buik? Waar is de linkerzijde en waar de rechter? Voorafgaand aan en tijdens de gastrulatie worden de drie lichaamsassen, respectievelijk de anteriore-posteriore (A-P), de dorsale-ventrale (D-V) en de links-rechts (L-R) as bepaald.
In muizenembryo’s is gevonden dat de bepaling van de A-P as zijn oorsprong heeft in het blastocyst stadium, waar een gebied wordt gespecificeerd door differentiële genexpressie van o.a. de transcriptiefactor GATA6. Dit gebied, anterior visceraal endoderm (AVE) genoemd, geeft vervolgens factoren af die essentieel zijn voor de vorming van het hoofd (figuur 5.3 A). Epiblastcellen die ver verwijderd zijn van het AVE gebied krijgen deze signalen niet en nemen de identiteit aan van de toekomstige staart/stuitje. De AVE signaalfactoren zijn o.a. Lefty1 (Left-Right Determination Factor 1), dit is een Nodal antagonist (remmer), DKK1 (Dickkopf-gerelateerd eiwit 1), een WNT antagonist en Cerberus, een multifunctionele antagonist van de paracriene factoren WNT, Nodal en BMP (Bone morphogenetic protein). Nodal en BMP zijn beide eiwitten uit de TGF-β familie van paracriene factoren. De naam Nodal refereert naar de primitive node, de primitiefknop. Deze wordt ook wel Hensen’s node of organizer genoemd, gezien zijn belangrijke functie in het organiseren van de verschillende structuren in het embryo. Hier komt Nodal tot expressie en deze factor initieert en onderhoudt vervolgens de vorming van de primitiefstreep. Samengevat: anterior wordt de functie van Nodal geremd (lage concentratie Nodal en hoge concentratie remmers, zie figuur 5.3 A) en wordt het hoofd gevormd; meer posterior, bij de primitief knop, is de activiteit van Nodal hoog (hoge concentratie Nodal en lage concentratie remmers) en wordt het caudale deel gevormd.
Over de bepaling van de D-V as bij zoogdieren is erg weinig bekend. Deze as wordt als eerste van de drie assen gespecificeerd. Al in het blastocyst stadium is er sprake van D-V polariteit aangezien de ventrale hypoblastcellen altijd aan de zijde van de blastocoel liggen en de dorsale epiblastcellen in contact staan met de amnionholte en de trofoblast. De primitiefstreep houdt deze polariteit vervolgens in stand, zodat epiblastcellen altijd in ventrale richting migreren tijdens de gastrulatie. Bij de verdere differentiatie van het mesoderm in dorsale en ventrale subtypen speelt de activiteit van de paracriene factor BMP4 een grote rol. Dit is gebleken uit onderzoek in met name Xenopus laevis (Afrikaanse of reuzenklauwkikker). BMP4 is aanwezig in het hele embryo, maar wordt onderdrukt in de gebieden die een dorsaal karakter krijgen. In aanwezigheid van zowel actief BMP4 als FGF wordt mesoderm geventraliseerd om later te ontwikkelen tot intermediair en laterale plaat mesoderm. Dorsaal, (par)axiaal, mesoderm ontstaat wanneer BMP4 lokaal wordt geremd. Dit gebeurt door een aantal factoren die afgegeven worden door de primitiefknop (en later door de chorda dorsalis). Deze BMP4 remmers zijn: Noggin, Follistatin en Chordin. Vanuit de knop ontstaat er een gradiënt van BMP4 remmers, waardoor het mesoderm dicht bij de knop gedorsaliseerd wordt en mesoderm dat verder weg ligt, en dus minder BMP4 remmers ontvangt, geventraliseerd wordt (figuur 5.3 B). Noggin, Follistatin en Chordin binden aan BMP4 en verhinderen daarmee dat BMP4 aan diens receptor kan binden. De signaaloverdracht tussen de inducer en de competente responder is op deze manier geblokkeerd. Dezelfde BMP4 remmers komen later tot expressie in de chorda dorsalis en spelen dan een belangrijke rol bij de neurale inductie (zie hoofdstuk 6).
Met het ontstaan van de D-V en de A-P as is ook de laatste as, de L-R as, van het embryo per definitie vastgesteld. De primitiefstreep op de middenlijn geeft beide zijden duidelijk weer. Echter, de ontwikkeling van een aantal organen verloopt vervolgens niet symmetrisch. Voorbeelden hiervan zijn het hart, de longen, de darmen, de lever, de alvleesklier en de milt. Deze organen zijn ofwel aan één kant gepositioneerd, ofwel anders van vorm aan de linkerkant vergeleken met de rechterkant. Deze L-R asymmetrie ontstaat vroeg tijdens de ontwikkeling en wordt aangestuurd door een cascade van signaleringsmoleculen en genen. De specificatie van de linkerkant gebeurt onder invloed van FGF8, afgegeven door de primitiefknop en -streep, en Nodal, Lefty2 en de transcriptiefactor PITX2, aan de linkerkant van het embryo. Daarnaast verhinderen Lefty1 en SHH de expressie van ‘linkerkant’ genen aan de rechterkant. Rechterkant specifieke genen zijn minder goed bekend, met uitzondering van de transcriptiefactor Snail waarvan de expressie beperkt is tot de rechterzijde. Waarschijnlijk stuurt de transcriptiefactor Snail andere genen aan, die verantwoordelijk zijn voor de bepaling van de rechterzijde (figuur 5.3 C). Wanneer de L-R asymmetrie niet juist ontwikkelt, is er sprake van situs inversus. De organen liggen gespiegeld in het lichaam. Dit hoeft niet problematisch te zijn, maar kan gepaard gaan met andere afwijkingen aan bijvoorbeeld de luchtwegen of de kwaliteit van de zaadcellen. Deze bevindingen hebben tot de ontdekking geleid dat één van de primaire stappen in het ontstaan van L-R asymmetrie te maken heeft met cilia (trilhaartjes) die aanwezig zijn op de primitiefknop. Deze cilia zijn qua structuur vergelijkbaar met de trilharen in de luchtwegen en de flagel (zweepstaart) van de zaadcellen. De cilia op de primitiefknop zorgen voor een linkswaartse stroming, de nodal flow. Het effect van de nodal flow op de totstandkoming van de linksrechts asymmetrie wordt verklaard door twee theorieën. Volgens de morfogeen hypothese zorgen de cilia op de primitiefknop voor een linkswaartse stroming waardoor factoren zoals FGF8 in hogere mate aanwezig zijn aan de linkerkant. Een andere theorie, de 2 cilia hypothese, stelt dat de beweeglijke cilia op de primitiefknop de nodal flow veroorzaken die vervolgens wordt gedetecteerd door de onbeweeglijke cilia in de periferie van de primitiefknop. Dit gebeurt via PKD2 (polycystic kidney disease 2), een calciumkanaal wat leidt tot een verhoogd calcium niveau aan de linkerkant. Calcium zou vervolgens asymmetrische expressie van Nodal pathway genen bewerkstelligen. Wanneer deze cilia niet goed functioneren, leidt dit tot luchtweginfecties en (mannelijke) onvruchtbaarheid, al dan niet in combinatie met situs inversus.