## Kwantitatieve bepalingen

Het piekoppervlak in een chromatogram is recht evenredig met de hoeveelheid stof die de detector passeert. Het probleem is dat niet iedere stof gelijk reageert op de detector. Zo kan een lage concentratie van een stof toch een hoge piek opleveren. Om dit op te lossen kunnen verschillende methodes gebruikt worden. We bespreken er twee:

- De interne standaard: er wordt een extra stof toegevoegd aan het monster met bekende concentratie. Door de verhoudingen tussen de pieken kan dan berekend worden wat de oorspronkelijke concentratie is.
- Standaardadditie: deze methode wordt vooral gebruikt bij ijkreeksen. Eigenlijk is dit een normale ijkreeks, maar het analyt wordt opgelost in het monster. Hiermee kunnen matrixeffecten verminderd worden.

Interne standaard

Een monster bevat een onbekende stof A die gemeten moet worden. Het chromatogram van het monster ziet er uit zoals hier rechts. Stof A heeft een retentietijd van 11 minuten. Bij het meten van het monster is 1·10–3 M van een stof S (de interne standaard) toegevoegd. De standaard heeft een retentietijd van 20 minuten. De verhouding tussen de piekoppervlakten van stof A en stof S is 1,25 : 1,00.

Dit wil dus expliciet niet zeggen dat er 1,25 keer zoveel stof A in het monster zit. We moeten eerst bepalen hoe verschillend de detector reageert op stof A in vergelijking met de standaard. Dit wordt ook wel de relatieve responsfactor genoemd. Deze is voor twee gegeven stoffen op een bepaald apparaat met vaste omstandigheden gelijk. Om deze te bepalen wordt een ander chromatogram opgenomen met daarin bekende hoeveelheden van stof A en stof S:

De concentraties van beide stoffen zijn gelijk aan elkaar: namelijk 1,0·10–2 M. De verhouding tussen de pieken is in dit geval 1,00 : 1,50.

Je kunt met deze gegevens nu uitrekenen hoe groot de concentratie stof A in het mengsel is.

Eerste aanpak:
De detector van de chromatograaf meet de piek van de standaard eigenlijk een factor 1,50 te groot ten opzichte van stof A (bij gelijke concentraties). In het daadwerkelijke chromatogram moet de piek van de standaard dus met een factor 1,50 verkleind worden.

Als we dat doen wordt de nieuwe verhouding tussen beide pieken:

Door deze correctie kunnen we de oppervlakten gelijk stellen aan de concentraties, en dat wil zeggen dat de concentratie stof A in het monster dus keer zo groot is als de interne standaard. De concentratie van stof A is dus: 1,87·10–3 M.

Tweede aanpak:
De eerste aanpak is over het algemeen goed te volgen voor leerlingen en bevordert het conceptueel denken. De tweede methode is gebruik maken van een formule:

Hierin is A de oppervlakte (area) van de piek, c is de concentratie van de stof en F is de relatieve responsfactor.

Als eerste wordt met behulp van het tweede chromatogram (alle concentraties bekend) de relatieve responsfactor bepaald:

Daarna kan de bekende F gebruikt worden om de onbekende concentratie van stof A in het monster te bepalen:

Standaardadditie

Een simpele ijklijn kan er als volgt uitzien:

Concentratie | Meting
0 | 0
2,0·10–2 | 0,098
4,0·10–2 | 0,154
6,0·10–2 | 0,234
8,0·10–2 | 0,301
10,0·10–2 | 0,334

Als er nu een monster gemeten wordt op 0,281 dan kan met behulp van de ijklijn (en bijbehorende formule) uitgerekend worden wat de concentratie van stof A is.

Dit is een heel beproefde methode die goed werkt op middelbare scholen en op allerlei situaties toegepast kan worden. Het probleem met de methode is dat in het monster vaak meer stoffen aanwezig zijn dan alleen stof A. Al deze andere stoffen kunnen ook bijdrage aan de meting die gedaan wordt. Hierdoor wordt niet alleen het effect van stof A gemeten, maar ook de andere stoffen. Dit is het zogenaamde matrix-effect.

Om dit te voorkomen moet de ijkreeks gemaakt worden met oplossingen die zoveel mogelijk op het monster lijken (en waarin eigenlijk alleen de hoeveelheid stof A variëert). Dit is erg lastig omdat vaak niet eens bekend is welke stoffen (en in welke concentraties) de matrix bevat. Als er voldoende monster is kan gekozen worden voor de standaardadditie methode. Wat er dan gebeurt is dat de ijkoplossingen gemaakt worden door aan het monster extra stof A toe te voegen. De ijkreeks ziet er dan bijvoorbeeld als volgt uit:

Toegevoegd A aan monster | Meting
0 | 0,262
2 | 0,360
4 | 0,416
6 | 0,496
8 | 0,563
10 | 0,596

Er is dan steeds aan het monster een extra hoeveelheid stof A toegevoegd. Het monster hoeft dan daarna ook niet meer opnieuw gemeten te worden. De eerste meting is namelijk het monster zonder toegevoegde A.

Om nu te bepalen hoeveel stof A er aanwezig was kan de grafiek als volgt gebruikt worden:

Op de x-as van de grafiek staat de hoeveelheid toegevoegde stof A. In het negatieve gedeelte van de x-as is dat dus de hoeveelheid verwijderde stof A. Als de meting waarde 0 oplevert dan is alle stof A verwijderd uit het monster. De invloed van de overige stoffen wordt hiermee teniet gedaan op de metingen. Door het doortrekken van de grafiek naar het negatieve gebied en het snijpunt met de x-as te bepalen is de hoeveelheid stof A te bepalen in het monster.