Isabella hield zich in haar laatste jaren vooral bezig met het bestuur van het ontluikende Spaanse wereldrijk en het zo goed mogelijk positioneren van haar vijf kinderen door strategische huwelijken. De dood van haar zoon kroonprins Johan en haar oudste dochter Isabella bezorgden haar veel verdriet. Isabella van Castilië legde op 14 september 1504 haar kroon neer, waarna zij op 26 november 1504 overleed. Zij werd opgevolgd door haar dochter Johanna, die later bekend zou komen te staan als ‘Johanna de Waanzinnige’, en haar schoonzoon Filips de Schone, onder wie Spanje echt verenigd werd. Isabella’s kleinzoon Karel zou als keizer Karel V regeren over een enorm wereldrijk, waartoe zij een grote aanzet heeft gegeven.